PET质粒表达对宿主菌的影响研究

大肠杆菌(Escherichia coli)是科研和工业生产上表达外源基因的常用宿主.然而,质粒的诱导表达常会给宿主造成强烈的代谢负担,导致菌体生长下降及自身蛋白合成产物减少,本研究通过对宿主菌培养基浓度对比,显微镜个体大小的观察和生长曲线测定,在表观程度上探索不同程度质粒表达对宿主菌的影响.结果表明pET质粒和空载的pET质粒经IPTG诱导表达对宿主菌的生长造成严重的抑制作用,实验组的OD600nm值比对照组平均减少53.56%,而且宿主菌对外界环境变化的应激力下降.

华支睾吸虫RPEF基因的克隆与序列分析

目的 构建华支睾吸虫成虫RNA聚合酶Ⅱ延长因子(RPEF)基因PET重组质粒,分析其编码序列。方法 根据RPEF基因已知序列设计一对引物,用PCR技术从华支睾吸虫质粒文库模板中扩增RPEF基因片段;将目的基因PCR产物和空质粒PET30a(+)同时用BamHⅠ和SalⅠ限制性内切酶双酶切,纯化回收后建立连接反应并转化大肠杆菌BL21。将构建的重组质粒PET30a(+)-RPEF经双酶切、PCR、测序鉴定后证明获得正确的重组克隆。结果 成功构建出RPEF基因原核重组质粒PET30a(+)-RPEF。序列分析表明,RPEF蛋白与鼠类RNApolymerase Ⅱ延长因子具有很高的同源性。结论 RPEF基因在华支睾吸虫基因表达调控机制中可能起重要作用。RPEF基因重组表达载体地PET30a(+)-RPEF的成功构建可为更深入地分析其基因功能、肝吸虫病药物靶标的筛选奠定基础。

宠物源大肠杆菌质粒介导喹诺酮类耐药基因流行性检测

【目的】对广州分离得到的宠物源(主要是宠物猫、狗)大肠杆菌进行质粒介导喹诺酮类耐药PMQR基因qnr、qepA和aac(6′)-Ib-cr基因的流行性检测。【方法】采用琼脂平板稀释法对164株临床分离的宠物源大肠杆菌进行15种抗菌药物的最小抑菌浓度测定。通过PCR检测qnr、qepA和aac(6′)-Ib-cr基因。建立大肠杆菌基因指纹图谱并对指纹图谱进行分析。【结果】164株宠物源大肠杆菌对12种兽医临床常用抗生素耐药率较高,且表现为多重耐药(5-14耐)。在164株宠物源大肠杆菌中检测到3个菌株同时携带qnrA、qnrB和qnrS基因,其中2株也携带aac(6′)-Ib-cr基因。阳性菌株均能扩增出指纹图谱,具有两个以上PMQR基因的菌株多分布于B型和C型。【结论】广州市宠物源大肠杆菌对临床常用抗菌药物耐药较为严重,检测结果显示喹诺酮类耐药基因在本市宠物医学临床上传播广泛,PMQR基因的产生能力与其基因型有密切的关系。

鲨肝刺激物类似物sHSA原核表达载体质粒稳定性的考察

研究原核表达载体pET-sHSA基因工程菌株传代50代过程中菌种的稳定性。采用LB液体培养基传代的方法考察了传代对菌种稳定性的影响,以菌体和菌落的形态、质粒稳定性(ST)、质粒酶切图谱及表达量等方面进行考察,以评价工程菌的稳定性。结果表明:pET-sHSA工程菌株在传代50代过程中具有较高的质粒稳定性,传代10代内质粒稳定性(ST)高达97%,传50代后质粒稳定性(ST)为82%。且重组产物表达量保持稳定,表达产物可达发酵液可溶性蛋白总量的40%,由此证明了表达载体pET-sHSA工程菌株具有传代稳定性,适合工业化生产。

人TNFβ缺失体融合表达及其产物一步纯化法研究

本文将hTNFβN端缺失 2 3aa的缺失体基因克隆于 pET 2 8 C(+ ) 表达载体 ,构建成T7lac启动子控制下His6 TNFβ融合表达质粒 ,转化到E coliBL2 1(DE3) ,经IPTG诱导表达 ,His6 TNFβ表达量约占总菌体蛋白的 2 5 % ,Mr2 0 5 0 0。表达产物大部分以包涵体形式存在。包涵体经过洗涤 ,70mol/L脲变性溶解 ,用Ni2 + 亲和层析一步快速纯化 ,所得His6 TNFβ的纯度达 90 %以上 ,回收率在 90 %左右。纯化产物稀释复性后 ,其细胞毒活性为 (0 5～ 1 0 )× 10 6U/mg蛋白左右。这些研究结果将为制备重组人TNFβ缺失体以及进一步研究其生物学功能奠定了基础。

S-腺苷甲硫氨酸合成酶的可溶性表达

系统考察了pET可溶性表达系统对酵母来源的S-腺苷甲硫氨酸(SAM)合成酶基因的表达情况,结果显示:当采用含Nus.Tag融合标签的pET-44a为载体,trxB和gor双突变的Ori-gami为宿主时最适合目的蛋白的可溶性表达。进一步考察不同来源(大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌)SAM合成酶的可溶性时,也得到了相似的结论;比较发现酵母来源的SAM合成酶可溶性表达的比活力最高达60.9U/mg。

重组人唾液淀粉酶A的制备及活性鉴定

目的利用基因工程制备重组人唾液淀粉酶A(rSAA),用其替代唾液中的SAA水解淀粉。方法设计一对带酶切位点的引物,PCR扩增SAA cDNA全长,将pET-28a质粒和PCR产物双酶切、连接。连接产物热激法转化大肠杆菌DH5α,于含卡那霉素的LB平板筛选抗性菌落,培养抗性菌落,抽提质粒,进行酶切和测序鉴定。将重组质粒(记为pS1)转化大肠杆菌BL21(DE3),用含卡那霉素的LB平板筛选抗性菌落(记为BL-pS1),培养BL-pS1,ITPG诱导rSAA表达。收集菌体,重悬于pH6.8的磷酸缓冲液,超声裂解,离心取上清,测试其水解淀粉的活性。结果构建了SAA cDNA的原核表达载体pS1,rSAA在宿主菌BL21(DE3)中获得可溶性表达,rSAA能高效水解淀粉。结论用rSAA取代唾液中SAA水解淀粉操作安全、取用方便、利于环保。