人β_2-微球蛋白在pET-22b(+)表达载体中的克隆、表达与纯化

目的 :构建人 β2-microglobulin( β2- M)基因的原核表达载体 ,在大肠杆菌中高效表达 β2 -M蛋白质并进行纯化 ,为构建MHC 肽四聚体奠定基础。方法 :从人外周血单核细胞中提取总RNA ,采用RT-PCR技术扩增出去除信号肽部分的 β2-M基因 ,克隆入pET-2 2b( + )表达载体进行诱导表达。采用离子交换层析和凝胶过滤方法对表达产物进行纯化 ,用ELISA和West ernblot法进行免疫学鉴定。结果 :成功地构建了表达载体pET-2 2b( + )- β2-M ,对表达产物进行了纯化 ,并对表达产物进行了鉴定。结论 :获得 β2- M蛋白的高效表达 。

pET 22b-TP17表达载体的构建与鉴定

目的:采用原核基因工程技术构建表达梅毒螺旋体外膜脂蛋白TP17的载体,并进行酶切鉴定,为获得重组抗原TP17及其用于梅毒血清学诊断试剂的研究奠定基础。方法:将化学合成的寡核苷酸(oligo)通过PCR的方法拼接成TP17目的基因的序列,并将合成好的序列克隆入pMD18-T Simple载体。以pMD18-T Simple-TP17为模板,PCR扩增TP17基因片段。PCR产物通过1.5%琼脂糖凝胶电泳回收TP17条带,随后用EcoRⅠ和XhoⅠ对TP17回收所得片段及目的载体pET 22b进行双酶切并连接。连接产物电转化至感受态细胞DH10B中后,挑取克隆,提取质粒并鉴定。最后将质粒转化至BL21菌株中。挑取克隆,提质粒,进行鉴定。结果:PCR扩增片段、双酶切均出现445 bp大小的目的基因条带,与预期结果相符。结论:本研究成功构建了重组质粒pET 22b-TP17,为下一步用IPTG诱导BL21菌株表达重组目的蛋白的研究奠定了基础。

人BMP4基因的克隆及其原核表达载体的构建

以成熟人胎盘组织为材料来源,克隆人BMP-4基因的全长cDNA,经过PCR扩增后与pMD18-T载体连接,构建pMD18-T-BMP4克隆质粒。酶切后回收小片段与表达载体pET-22b的多克隆酶切位点连接,构建原核表达载体pET22b-BMP4,酶切及测序鉴定重组子。重组质粒转化至感受态的Rosseta宿主菌,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测蛋白表达情况。结果显示,从胎盘组织中成功地克隆到人BMP4基因,与NCBI中公布的序列100%相符合,原核表达载体pET22b-BMP4转化至Rosseta构建表达菌体,经IPTG诱导后电泳分析可见重组蛋白表达的条带。

牛疱疹病毒I型gB基因的原核表达

根据GenBank中BHV-1 Colorado 1毒株的全基因组序列,针对gB基因的主要B细胞免疫区域设计一对引物。提取BHV-1 Colorado 1毒株的基因组DNA,PCR扩增大小为585 bp的gB片段,将其克隆至pET-22b(+)原核表达载体并测序分析,同时用Nde I和Not I酶切鉴定。SDS-PAGE和Western blot试验结果证明,获得的可溶性gB重组蛋白能与牛传染性鼻气管炎病毒标准阳性WEI血清发生特异性反应,为ELISA等免疫诊断方法的建立奠定了物质基础。

人成纤维细胞生长因子-21分泌型表达及鉴定

利用基因工程手段,将人成纤维细胞生长因子-21(hFGF21)与分泌信号肽相融合,构建得到能够分泌表达FGF21蛋白的表达载体。将该表达载体导入到Rosetta(blue)宿主细胞中,在分泌信号肽的引导下,在细胞周质中表达。经IPTG诱导表达可获得分子量为21 kD的蛋白,Western-Blotting证明该蛋白为FGF21蛋白。经SDS-PAGE证明获得了可溶性的FGF21蛋白。该方法简化了纯化工序,提高了成品率,使大规模生产重组人成纤维细胞生长因子-21(rhFGF21)成为可能。

导向性IFN-α2a-α-MSH基因的克隆、表达、纯化及鉴定

目的:构建导向性IFN-α2a-α-MSH融合基因的原核表达载体,并建立重组蛋白的原核高效表达体系.方法:将本实验室已构建的pET-22b(+)IFN-α2a-NGR用BamH I和SalI限制性内切酶进行双酶切,将得到的大片段与设计的α-MSH多肽片段退火后的产物进行连接,构建原核表达载体pET-22b(+)IFN-α2a-α-MSH,将序列鉴定正确的重组质粒转化入Rosetta-gamiTM2(DE3)大肠杆菌,IPTG诱导表达目的蛋白.对表达产物进行SDS-PAGE及Western Blot鉴定.结果:在大肠杆菌中成功实现了IFN-α2a-α-MSH的稳定高效表达,表达产物以包涵体形式存在,采用超声裂菌的方法,用疏水作用层析技术获得较高纯度的重组蛋白.结论:成功克隆、表达和纯化了IFN-α2a-α-MSH蛋白.

高产S-腺苷蛋氨酸合成酶基因工程菌的构建

应用PCR技术,以大肠杆菌BL21(DE3)染色体DNA为模板,扩增得到S-腺苷蛋氨酸(SAM)合成酶基因。将所得基因连接至表达载体pET-22b(+),利用T7强启动子进行转录,然后转化进E.coli BL21(DE3)表达菌株,构建出了具有高效表达SAM合成酶基因的基因工程菌。重组菌所表达的酶活为115 U/g(以细胞干重计)。

Expression of human β-subunit nerve growth factor(hNGFB) in yeast Pichia pastoris and E.coli

The gene hNGFB encoding the β subunit of human nerve growth factor (hNGF) was cloned into P. pastoris secretive expression vector pHIL-S1 and E. coli expression vector pET-15b. The recombinant hNGFB vectors pSNGF and pET15b-NGF were transformed into P. pastoris host cell GS115 (Mut^+ , His^- ) and E. coli strain BL21 (DE3) respectively. Expression and secretion of hNGFB in P.pastoris was attempted under the direction of the AOX1 promoter and PHO1 signal sequence. The positive colonies growing on medium without histidine were further selected by PCR. The yield of rehNGFB in GS115 was about 14.4% of total cellular secretive protein. The secreted protein was immunological active on Western blotting with rabbit anti-mNGFB antibodies. The fusion protein yield of rehNGFB in E. coli BL21 (DE3) was about 10.3% of total cellular protein after IPTG induction. Western blot detection showed its immunological activity.