生长抑素(SS)基因在pET-32表达系统中的高效表达

分别将SS基因克隆至pET 32a和pET 32c表达系统中 ,得到重组质粒SS N/X和SS N/S。实验结果表明 ,SS N/X Thioredoxin (硫氧还原蛋白 )和SS N/S Thioredoxin融合蛋白在IPTG (异丙基硫代 β D半乳糖苷 )诱导 3h后(37℃ )表达产量最高 ,约占菌体总蛋白的 30 %左右。 0 0 5～ 1mmol·L-1IPTG对SS融合蛋白表达产量的影响并不太大 ,0 0 5mmol·L-1IPTG即可达到有效的诱导效果 ,但单位体积内的表达产量以 0 5mmol·L-1时为最高。乳糖诱导 4h(37℃ )的效果明显低于IPTG ,但当培养时间延长至 8h时 ,2 0mg·mL-1的乳糖可达到与IPTG同样的诱导效果 ,10和 5mg·mL-1的乳糖也可接近IPTG的诱导效果。SS N/X融合蛋白在 2 6℃表达时 ,主要以可溶性形式存在 ,占75 8% ,包涵体仅占 2 4 2 % ;而SS N/S融合蛋白则主要以包涵体形式存在 ,占 6 0 2 % ,可溶性蛋白仅占 39 8%。SS可溶性融合蛋白具有良好的SS抗原性。

牛源HSP70基因点突变、分子进化和pET32a-c(+)原核表达

设计引物PCR方法克隆了奶牛1926bp的HSP70基因,连接到pGEMR○-T Easy Vector上测序,与NCBI上的序列比对,发现开放阅读框内的点突变(941位点,T→C),致使314位L(亮氨酸)→P(脯氨酸)。DNAstar Protean分析点突变对蛋白的原核表达一、二级结构、等电点进行了分析,结果显示螺旋转角区数目增多,不规则卷曲发生轻微变化,但其它指标均不变。此外,通过DNAstar MegAlign用Clustal V方法分析HSP70家族蛋白的同源性、氨基酸残基替换频率并构建了分子进化树,结果发现碱性、酸性氨基酸(R和K)、分支的氨基酸(V和L)、极性氨基酸(S和T)等在生物HSP70分子进化中氨基酸发生替换的频率最高,HSP70可以作为研究生物系统演化的一个重要的工具。在上述基础上,在HSP70基因上、下游引物分别加上EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点,构建了pET-32a-c(+)-bHSP70原核表达质粒,IPTG诱导成功得到重组牛源HSP70蛋白,293细胞和Hela细胞的体外实验表明原核表达的蛋白有抗凋亡生物活性[动物学报51(6)1080-1090,2005]。

重组人胰岛素原基因高效表达和纯化的研究

克隆人胰岛素原基因,通过密码子优化和融合蛋白化学水解位点和纯化标签优化,构建人胰岛素原高效原核表达系统,为重组人胰岛素原的高效表达纯化制备奠定基础。根据大肠杆菌密码子偏好性优化设计人胰岛素原基因,通过PCR技术获得重组基因,构建原核表达载体pET-32a-proinsulin,转化大肠杆菌表达株E.coli BL21,筛选人胰岛素原高效表达菌株,建立诱导表达和纯化融合蛋白技术方法。克隆获得优化的人胰岛素原重组基因,构建原核高效表达载体,获得优化的诱导表达方法和纯化的人胰岛素原。该研究为建立胰岛素高效制备的优化条件奠定基础。

鸡骨钙素蛋白的原核表达及其生物学活性

为获得具有生物活性的骨钙素蛋白,以鸡颅骨提取的总RNA为模板,RT-PCR法克隆鸡骨钙素成熟肽DNA,连接至原核表达载体pET-32a(+),构建表达质粒pET-32a(+)-rchOC。质粒转化Rosetta-gami(DE3)pLyS宿主菌,IPTG诱导表达含His标签的重组蛋白His-rchOC。肠激酶酶切去除融合蛋白中的His标签后获得重组骨钙素蛋白(rchOC)。通过与羟基磷灰石结合试验、MTT及PNPP法分析该蛋白生物学活性。结果显示:重组骨钙素蛋白能与羟基磷灰石结合,抑制成骨细胞中碱性磷酸酶的表达,但不影响成骨细胞的增殖。结论:经原核表达系统已成功获得鸡重组骨钙素蛋白,且该蛋白具有生物活性。

猪血管内皮细胞中分子伴侣Jiv90基因的克隆与原核表达

克隆到猪Jiv90基因,构建原核表达载体并在大肠埃希菌中表达。从猪血管内皮细胞中克隆到Jiv90基因,将其克隆到pET-32a载体上,构建出重组表达载体,经IPTG诱导表达。结果表明,本试验成功克隆了大小为693 bp的基因,重组质载体pET-32a-Jiv90所表达的蛋白在大肠埃希菌中以包涵体的形式存在,表达产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定大小为46 ku,与预期结果一致。为进一步研究该蛋白的功能及制备抗体奠定了基础。

血管内皮生长因子在大肠杆菌中表达、提纯及功能测定

目的:利用细菌表达系统合成大量重组血管内皮生长因子(VEGF)蛋白。方法:将VEGF165cDNA克隆于表达载体PET-32a(+)后转染BL-21株表达重组VEGF蛋白,用分离His蛋白的层析柱提纯重组VEGF蛋白。结果:重组VEGF蛋白经氨基酸序列测定证实。Western blot测定发现His蛋白。功能测定发现重组VEGF蛋白可阻断细胞表面Neuropilin-1的表达。

番茄黄化曲叶病毒CP基因的原核表达载体构建选择

[目的]筛选出目的蛋白能够高效表达的重组质粒。[方法]利用原核表达载体pET-32a(+)和pET-28a(+)成功构建了番茄黄化曲叶病毒(Tomato Yellow Leaf Curl Virus,TYLCV)外壳蛋白(Coat Protein,CP)基因的重组质粒p32a-CP和p28a-CP,并通过PCR和双酶切鉴定了序列连接的正确性;再分别将2个载体转化至BL21(DE3)中,采用不同浓度的IPTG对其进行诱导表达,并进行SDS-PAGE电泳检测。[结果]测序结果显示TYLCV-CP基因已定向插入p32a-CP和p28a-CP中;SDS-PAGE电泳结果显示分子量约为50 kD的目的蛋白在重组载体p32a-CP中得到了高效表达,而在重组载体p28a-CP中未表达。[结论]为下一步的抗体制备及TYLCV的免疫学检测奠定了基础。

狂犬病病毒N、G两种蛋白在间接ELISA方法中的应用比较

目的比较狂犬病N、G两种蛋白检测抗体效果。方法本研究先通过比较pET-32a(+)和pGEX-6P-1两种载体表达的狂犬病病毒G蛋白和N蛋白,采用碳酸盐纯化表达量高的两种蛋白,再以纯化的抗原用于检测93份免疫犬血清。结果 (1)以pGEX-6P-1为载体的N、G两种蛋白表达量较高。(2)碳酸盐包被液可以得到纯度较高的蛋白。(3)间接ELISA检测93份抗体,其中56份G蛋白高于N蛋白,37份N蛋白高于G蛋白。(4)血清样本检测结果都为阳性,表明免疫效果良好。结论针对N、G两种蛋白的抗体在动物体内出现时间不同,哪种抗体出现的早,有待于我们进一步研究。

Taq DNA聚合酶的热纯化制备

[目的]提高Taq DNA聚合酶的制备效率。[方法]利用Ni柱亲和色谱纯化载有6xHis标记的Taq DNA聚合酶,并重组载体,利用Taq DNA聚合酶的耐热特性,对粗提液75℃处理1h,之后通过PCR试验验证制备酶液的活力。[结果]所获重组的pET-32A-Taq能够在BL21(DE3)宿主菌中高效表达并可通过热变性去除杂蛋白,获得了活力远高于购买的Taq DNA聚合酶的酶制剂。[结论]使用热纯化法制备的Taq DNA聚合酶工艺简单,成本较低,能满足常规大量PCR实验要求。

环鸟苷二磷酸代谢相关基因PXO_03877的原核表达

分别利用表达载体pET-32a(+)和pGEX-4T-1,对水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzaepv.oryzae,简称Xoo)中环鸟苷二磷酸代谢相关基因PXO_03877进行了原核表达,并进行可溶性检测。结果显示,用pET-32a(+)载体构建的表达质粒载体经诱导后,重组蛋白大多位于沉淀而非上清中,经诱导条件优化后,蛋白仍以包涵体形式存在;而利用pGEX-4T-1载体表达的含有GST标签的重组蛋白为可溶性蛋白,可用于下一步纯化后进行功能分析。

Preparation of Taq DNA Polymerase by Thermal Purification

[Objective] The paper was to improve the preparation efficacy of Taq DNA polymerase. [Method] Ni column was used to purify Taq DNA polymerase carrying with 6xHis tag,and recombined vector. Using the thermal-resistant characteristics of Taq DNA polymerase,the crude extract was treated at 75 ℃ for 1 h,and the activity of prepared enzyme solution was verified by PCR test. [Result] The recombinant pET-32A-Taq could highly express in BL21 （DE3） host bacteria and remove hybrid protein by thermal denaturation. The enzyme preparation with the activity further higher than purchased Taq DNA polymerase was obtained. [Conclusion] Taq DNA polymerase prepared by thermal purification method is simple with low cost,and can meet the needs of a large number of conventional PCR amplification.

人类肥胖基因瘦素蛋白的原核表达

目的 :原核表达人类肥胖基因瘦素蛋白。方法 :以携人类肥胖基因的 p UC119- ob为模板 ,PCR扩增瘦素蛋白基因片段 ,并克隆到 p ET- 32 a构建重组表达质粒 p ET- 32 a- ob,经酶切和测序鉴定后 ,转化至大肠埃希菌 DH5 α中表达 ,SDS- PAGE电泳鉴定表达产物。结果 :测序和限制性分析均证明了 p ET- 32 a- ob的序列正确 ,转化的 DH5 α可高效表达一个 30 k D融合蛋白 ,与预期结果一致。结论 :经 p ET- 32 a- ob转化的DH5 α可有效表达重组人类瘦素蛋白 。

重组胶质细胞生长因子2蛋白的原核表达及纯化

目的通过原核表达的方法得到胶质细胞生长因子2(GGF2)重组蛋白。方法将不含信号肽编码序列的GGF2基因用亚克隆的方法自PVT-GGF2质粒克隆至PCXJ18质粒,再由PCXJ18-GGF2质粒克隆至pET-32b(+)质粒,构建pET-32b(+)-GGF2表达载体。表达载体转染4种宿主菌,筛选合适者。优化表达时程和IPTG诱导剂量。GGF2大量表达后回收包涵体,复性。复性产物利用His Bind树脂进一步纯化。纯化产物用Western blot鉴定。结果测序鉴定表明,成功构建pET-32b(+)-GGF2表达载体。筛选结果表明Origami B(DE3)为合适宿主菌。适宜的表达条件为30℃诱导前扩增,浓度25μmol/L IPTG,37℃诱导2 h。所表达外源蛋白相对分子质量和预期一致。回收、纯化后得到纯度约为96%的产物。Western blot鉴定表明所获为GGF2重组蛋白。结论原核表达方法得到足量GGF2重组蛋白。

病毒样颗粒内标在荧光定量RT-PCR检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒方法中的应用

为建立对高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(H-PRRSV)快速准确的检测方法,本试验构建兽医临床用病毒样颗粒内标表达载体,制备检测H-PRRSV的病毒样颗粒内标。在H-PRRSV Nsp2基因保守区域设计了1对特异性引物和1个TaqMan荧光探针,通过对反应体系和扩增条件的优化,建立了检测H-PRRSV的荧光定量RT-PCR检测方法;将MS2噬菌体的成熟酶蛋白和衣壳蛋白基因序列定向插入pET-32a载体的相应位置,在载体下游插入人工合成包含引物和探针的内标基因序列,采用双酶切和PCR鉴定阳性质粒,将阳性质粒转化大肠杆菌BL21工程菌,IPTG诱导表达,制备了病毒样颗粒内标。试验结果表明,所建立的方法特异性强,灵敏度高,对8份已知病毒的检测结果显示特异性为100%,检测滴度为1TCID50/mL病毒液,对42份临床样本的检测结果与农业部备案试剂盒检测结果完全一致,体现了较好的实用性。

TAT-Apoptin基因原核表达载体的构建及其表达鉴定

为得到TAT-Apoptin融合蛋白,以pMD-19T-Apoptin为模板PCR扩增出TATApoptin基因,构建重组载体pET-32a-TAT-Apoptin,并对TAT-Apoptin蛋白进行表达。PCR和测序表明,成功构建重组载体pET-32a-TAT-Apoptin,进一步对其进行蛋白表达,发现该蛋白能与Apoptin多抗发生特异性结合。以上结果证明,TAT-Apoptin基因原核表达载体构建成功,并能在Rosetta中进行分泌性表达。

腺苷脱氨酶三种原核表达载体的构建及蛋白表达

目的利用分子克隆技术表达腺苷脱氨酶蛋白。方法从人白细胞中提取总RNA,逆转录为cDNA,再以其为模板,采用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增腺苷脱氨酶基因,然后将目的基因连接到3种原核质粒pET-28b、pET-32a(+)和pHSIE中,再将测序完全正确的克隆质粒用CaCl2法转化入大肠杆菌BL21(DE3)中进行蛋白表达,并筛选最优表达条件,经Western-blot和SDS-PAGE鉴定蛋白表达情况。结果 3种质粒载体携带的目的基因DNA测序结果证实其很好地连接入载体质粒,表达的ADA蛋白经Western-blot和SDSPAGE鉴定符合,最优表达条件为诱导剂IPTG浓度0.4mmol/L,表达温度为16℃,表达时间为24h。结论该实验成功构建了腺苷脱氨酶的3个原核载体(BL21+pET-28b+ADA,BL21+pET-32a+ADA,BL21+pHSIE+ADA),且3个载体均成功高效表达了腺苷脱氨酶蛋白。

香菇C_(91-3)菌凋亡相关基因24414功能域片段原核表达载体的构建

目的构建高效快速且方便的His-标签原核表达体系,对香菇C91-3凋亡相关基因24414功能域进行克隆。方法根据香菇C91-3凋亡相关基因24414的基因序列,分别设计特异性上下游引物,采用PCR方法,以24414基因序列为模板,扩增出24414基因的功能域序列。并将功能域基因连入pMD19-T Simple Vector克隆载体中,进行蓝白斑筛选,挑选出阳性菌落,提取质粒经双酶切及PCR验证后,进行基因测序。将克隆载体上目的基因连入pET-32a原核表达载体,构建重组质粒。转化入E.coli JM109宿主菌,经双酶切验证后,进一步测序鉴定验证重组质粒。结果 PCR扩增出大小为747 bp的基因片段,测序结果显示与香菇C91-3凋亡相关基因24414的功能域片段同源性为100%,并成功构建了原核表达体系。结论重组原核表达载体pET-32a-24414的成功构建为进一步研究香菇C91-3凋亡相关基因24414功能域的表达纯化及生物学活性奠定了基础。