pET28a-TAT-LacZ重组子的构建

为了构建高表达pET28a-TAT-LacZ重组子,观察表达的融合蛋白TAT-β-Gal能否穿过生物膜,使用人工合成编码TAT蛋白转导区的DNA片段,插入载体pET28a组氨酸编码区后再连接lacZ基因,组成pET28a-TAT-LacZ重组表达子,转化大肠杆菌,利用组氨酸亲和层析柱纯化TAT-β-Gal融合蛋白,将融合蛋白加入培养的平滑肌细胞。得到高度纯化的、有活性的TAT-β-Gal融合蛋白,TAT-β-Gal在短时间内进入体外培养平滑肌细胞,成功地构建了高表达pET28a-TAT-LacZ重组子,并在体外培养的细胞中证实TAT-β-Gal融合蛋白穿透生物膜的能力,为肽类、生物大分子药物进入组织细胞内发挥治疗作用提供了理论基础。

Molecular cloning of virB12 gene of Brucella melitensis 16M strain in pET28a vector

Objective:To clone the virB12 gene in pET28a expression vector for production of recombinant protein to be used as antigenic component for future serological test development.Methods: Brucella melitensis(B.melitensis) 16M strain was cultured and bacterial DNA was extracted by Bioneer AccuPrep~ Genomic DNA Extraction Kit.Oligonucleotide primer pair was designed based on Brucella virB12 gene sequence with BamHI and HindIII restriction site at 5’ end of the forward and reverse primers,respectively.DNA amplification was performed using PrimSTAR~ HS DNA polymerase and the PCK product was purified by DNA AccuPrepGel Purification Kit.Purified DNA was cloned into pJET1.2 cloning vector.VirB12 gene fragment was excised from pJET1.2 asing BamHI/HindIII and subsequendy subcloned into pET28a(+).Results:Brucella virB12 gene was successfully cloned in pJET1.2 and then in pET28a(+) plasmids.PCR and restriction enzyme digestion confirms the procedure.Conclusion:We cloned and expressed the Brucella virB12 gene which could be used as antigenic component for specific serological assay development.

灭活剂对BL21-(PET28a-HA9801)灭活下游工艺影响的研究

目前国内生产的有效预防猪链球菌疾病的有效亚单位疫苗,是采用大肠杆菌重组蛋白作为抗原,在大肠杆菌发酵后的灭活工艺环节,多采用灭活剂甲醛进行重组大肠杆菌的灭活,灭活效果良好,但是对于下游蛋白纯化工艺的影响没有相关报道研究,为了研究灭活剂甲醛对于猪链球菌重组大肠杆菌BL21-(PET28a-HA9801)表达蛋白纯化收率影响。本研究利用猪链球菌重组大肠杆菌BL21-(PET28a-HA9801)进行菌培养,利用试验组0.2%甲醛灭活和对照组无甲醛灭活,分别进行菌体破碎,蛋白纯化,比较试验组和对照组,在蛋白纯化过程及蛋白纯化后蛋白得率进行对比分析,结果表明,试验甲醛添加组对与菌体破碎效果及亲和层析纯化、蛋白得率都有显著影响,因此得出结论甲醛对于猪链球菌重组大肠杆菌BL21(PET28a-HA9801)灭活效果良好,但是对于下游纯化蛋白收率影响较大,不适宜作为猪链球菌重组大肠杆菌BL21(PET28a-HA9801)灭活的最佳灭活剂。

重组大肠杆菌γ-谷氨酰转肽酶的PET载体的选择及乳糖诱导作用的初步研究

采用PCR技术以E.coliK-12基因组DNA为模板扩增出γ-谷氨酰转肽酶基因,克隆至原核表达载体pET28(a)和pET32(a)中,经测序鉴定后转化大肠杆菌BL21(DE3),借助SDS-PAGE分析方法,对于用乳糖诱导,由T7lac启动子控制的重组目的产物蛋白的表达规律进行了优化研究。在对诱导条件进行优化控制的前提下,分析比较了乳糖诱导pET28(a)/γ-ggt和pET32(a)/γ-ggt两种重组质粒表达大肠杆菌γ-谷氨酰转肽酶蛋白的可溶性及酶活。实验结果表明,对于T7lac启动子控制的重组目的产物,乳糖作为诱导剂也可以起到很好的诱导表达效果,低温培养下,乳糖诱导pET32(a)/γ-ggt重组质粒表达γ-谷氨酰转肽酶具有更高的蛋白可溶性和酶活。

应用pET系统表达rhIFN-α2b基因的研究

目的 以构建的pET28a为表达载体,探讨人 IFN-α2b基因在pET系统中的表达。方法 合成引物,通过PCR扩增人 IFN-α2b基因并引入点突变,在不改变天然 IFN-α2b氨基酸序列的前提下,使原 IFN-α2b基因4个大肠杆菌稀有密码子改变为偏爱密码子,在起始密码子后,编码前16个氨基酸的碱基序列均成为大肠杆菌的偏爱密码子。将PCR产物次级克隆人pET28a载体,构建重组表达载pET28a-IFN-α2b。筛选正确的重组表达质粒pET28a-IFN-α2b转入感受态表达菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,粗提并检测 IFN-α2b活性。结果 重组质粒pET28a-IFN-α2b在宿主菌 BL21(DE3)中表达出的rhIFN-α2b以可溶性蛋白形式存在于粗提上清液中,与原来 pBV889系统表达的干扰素相比,具有更高的生物学活性。结论 应用pET表达系统可表达出具有更高生物学活性的rhIFN-α2b蛋白。

HIV TAT——一种生物大分子的运载体

人工合成编码TAT蛋白转导区核心区域11个氨基酸的双链寡核苷酸,构建pET28a-TAT-LacZ表达子,转化大肠杆菌,得到高表达的TAT-β-Gal融合蛋白。TAT-β-Gal加入体外培养的平滑肌细胞中,15min细胞即出现蓝染,1h TAT-β-Gal 100％进入细胞。该融合蛋白ip到Wistar大鼠体内,30min各组织出现蓝染,4h光密度值达高峰。实验证明TAT蛋白可有效携带大分子物质穿过生物膜,是一良好的生物大分子运载体。

臭鼻杆菌腈水解酶基因(bxn)的克隆及其在原核生物中的表达

通过PCR技术从克雷伯氏臭鼻杆菌基因组DNA中克隆到编码腈水解酶的基因(bxn),插入pET28a(+)载体的NcoI和SacI之间,构建了bxn基因的原核生物表达载体pET-BX。通过SDS-PAGE鉴定出重组克隆,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达出了一种37.7 kD的特异蛋白,其表达量占宿主菌总蛋白的18.2%。在添加终浓度为4mmol/L的乳糖和28℃培养条件下,重组克隆菌可表达较高产量的特异酶蛋白,可将溴苯腈降解为无毒物质,并具有较高活性。

重组大肠杆菌细胞不对称还原4-氯乙酰乙酸乙酯合成(R)-(+)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯

从赭色掷孢酵母(Sporobolomyces salmonicolorZJU0105)中克隆出NADPH依赖型醛基还原酶基因,构建了重组大肠杆菌E.coliBL21(pET28-ALR0105),该工程菌可以高效地表达醛基还原酶.将重组细胞用于催化4-氯乙酰乙酸乙酯不对称还原,合成出具有光学活性的(R)-(+)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯.实验发现,在加入适量辅酶及辅酶再生酶的条件下,利用重组细胞催化还原反应可以获得比使用赭色掷孢酵母更高的转化率、产率和ee值,得到了几乎是光学纯的(R)-(+)-型产物,从而解决了酵母细胞催化此类反应ee值较低的问题.考察了辅酶及共底物的添加、底物和产物的浓度、pH值、温度以及菌体密度等因素对还原反应的影响.结果表明,不对称还原反应必须在辅酶NADPH和辅酶再生酶系及共底物葡萄糖的参与下进行;底物和高浓度的产物对还原反应有一定的抑制作用;当pH>6.0时,反应的转化率及产率都显著降低;高密度重组细胞可以减小底物的抑制作用.

蜘蛛大壶状腺丝蛋白基因的克隆和原核表达

以悦目金蛛(Argiope amoena)丝腺SMARTRACEcDNA文库为模板进行RT-PCR,克隆了1条大壶状腺丝蛋白(major ampullate spidroin,MaSp)基因cDNA序列。该条cDNA序列编码的氨基酸序列可区分为两部分(1)富含丙氨酸的片段和富含甘氨酸的片段相间排列构成的重复氨基酸序列区,并且富含甘氨酸的片段中有脯氨酸分布;(2)约100个氨基酸残基组成的C末端非重复氨基酸序列区。把MaSp基因cDNA序列亚克隆到质粒pET28b(+)中,构建原核表达质粒pET28b(+)-MaSp,表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达。SDS-PAGE、氨基酸组成测定和N末端氨基酸序列测定的结果表明,表达产物为重组MaSp,表达量约为40mg/L。还对C末端非重复氨基酸序列对重组MaSp在水媒介中溶解性的影响进行了探讨。

玉米APX基因的克隆及其原核表达研究

为了研究冷胁迫处理下的玉米抗坏血酸过氧化物酶的作用,根据GenBank发表的APX基因的ORF序列设计引物,利用RT-PCR从冷胁迫后的玉米自交系(E28)叶片总RNA中经cDNA转化,pMD19-T载体的亚克隆,获得APX基因开放阅读框,长度为753 bp,编码250个氨基酸残基。生物信息学分析显示,APX相对分子质量和理论等电点依次为27.3 kDa和5.56。将携带完整的ORF序列连入表达载体pET-28a(+)中,APX基因经IPTG诱导后高效表达,SDS-PAGE电泳检测到目标蛋白的大小约为27.3 kDa,与预测结果一致。抗盐分析显示,重组大肠杆菌BL21(pET28-APX)的抗盐性明显高于对照菌株BL21(pET28)且其抗NaCl的临界浓度为0.6 mol/L,这为后期对作物的抗逆研究提供了科学依据。

果胶裂解酶基因PelC表达载体的构建及原核表达分析

从实验室分离保存的1株产果胶酶的菌株(BTC105)中克隆果胶裂解酶基因(PelC)完整开放阅读框,通过载体构建,将目的基因连接到表达载体pET28a上,转化大肠埃希菌BL21(DE3)进行融合表达,在LB(Luria-Bertani)中进行摇瓶发酵,1 mmol/L IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导。结果表明,构建了表达载体pET28a-pelC,果胶裂解酶主要在胞内表达,酶活最适pH为5.4,最适温度为50℃,Ca^(2+)对酶活促进作用最为明显,Cu^(2+)完全抑制了酶的活性。

日本血吸虫重组质粒pET28α—Sj26GST—Sj32的构建及其在大肠埃希菌BL21（DE3）中的表达

目的构建日本血吸虫重组质粒pET28α－Sj26GST—Sj32，观察该质粒在大肠埃希菌BL21（DE3）中的表达。方法超声粉碎日本血吸虫成虫，提取总RNA，通过RT—PCR扩增获得Sj26GST和Si32抗原编码基因，然后采用基因拼接法剪接Sj26GST和Sj32，得到Sj26GST—Sj32融合基因，克隆至大肠埃希菌原核表达载体pET28α，构建重组质粒pET28α-Sj26GST—Sj32，转化大肠埃希菌BL21（DE3），经异丙基硫代-β—D-半乳糖苷（IPTG）诱导表达后用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）和Western印迹法对表达产物进行分析和鉴定。结果基因拼接法扩增出长度约1991bp的Sj26GST—Sj32融合基因；双酶切和PCR鉴定证实Sj26GST—Sj32融合基因成功插入pET28α中，SDS—PAGE分析显示表达产物为相对分子质量约69×10^3的重组蛋白．与预期结果一致，表达的蛋白约占菌体总蛋白的25％；Western印迹法鉴定重组蛋白能被日本血吸虫感染的兔血清识别。结论成功构建了日本血吸虫重组质粒pET28α—Sj26GST—Sj32，该质粒在大肠埃希菌BL21（DE3）中获得了高效融合表达，表达的融合蛋白具有特异的抗原性。

融合酶表达载体的构建及出现问题的初探

目的:将限制性内切酶FokⅠ催化区域基因(631bp)和PI-SceⅠ识别区域的基因(546bp)连接到一起,克隆入载体质粒pET28a+中,为表达新的限制性内切酶融合酶做准备。方法:分别以啤酒酵母和海床黄杆菌作模板,PCR扩增PI-SceⅠ和FokⅠ基因片段,再将它们克隆入载体质粒pET28a+,然后对整合质粒进行双酶切检测。结果:整合过程中,无论是PI-SceⅠ还是FokⅠ基因片段,都能单独成功插入载体,但当插入第二段基因片段时,酶切结果显示大约600bp的基因片段缺失了。结论:缺失可能因为两段连在一起的新基因在转化过程中对宿主细胞有毒性,宿主细胞对其进行了剪切;也可能这两段基因会形成某种高级结构而导致其不能很好的连接,产生缺失现象。

耐高温葡萄糖异构酶重组菌发酵与转化条件研究

耐高温的葡萄糖异构酶(glucose isomerase,GI)在高温下可将D-葡萄糖异构化为D-果糖,获得的高果糖浆可作为甜味剂应用于食品诸多领域。对Thermus oshimai GI重组菌发酵产酶条件和全细胞转化D-葡萄糖生成D-果糖工艺进行研究。确定诱导温度28℃,诱导剂终浓度0.1 mmol/L,发酵培养基添加5 mmol/L Mn^(2+)的最优产酶发酵条件;将最优转化体系放大,包括20 g/L湿菌体、10 mmol/L Mn^(2+)和200 g/L底物,于95℃和pH 7.5条件下生物转化4 h,D-果糖得率高达57.34%。该工艺具备一步法生产F55型高果糖浆的可能性,可简化后续浓缩分离等步骤,为进一步使用食品安全的表达系统生产F55型高果糖浆提供理论依据。

卡介苗HSP70的表达、纯化及活性检测

目的:在大肠杆菌中表达并纯化出具有良好生物学活性的卡介苗HSP70(BCG HSP70)蛋白。方法:利用PCR技术扩增出BCG HSP70的编码基因,将其克隆到pMD18-T载体,测序分析。再将该目的基因亚克隆至pET28a表达载体,转化入大肠杆菌BL21(DE3),获得正确的阳性克隆子后,用IPTG诱导表达。纯化表达产物,SDS-PAGE及Western blot鉴定目的蛋白,并通过脾增生实验检测其生物学活性。结果:扩增的BCG HSP70基因经序列测定与GenBank公布的序列完全一致。表达产物经SDS-PAGE分析,在相对分子质量(Mr)约70000处有表达条带。Western blot结果证实纯化产物在Mr约70000处可见特异性条带。蛋白纯度约96.5%。脾细胞增生试验显示,该蛋白能够明显刺激鼠脾细胞增殖。结论:成功表达并纯化了具有良好生物学活性的BCG HSP70,为进一步研究BCG HSP70及BCG的功能奠定了基础。

日本血吸虫重组质粒pET28α-Sj32的构建及其在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达

目的构建日本血吸虫重组质粒pET28α-Sj32,研究该质粒在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达。方法超声粉碎日本血吸虫成虫,提取总RNA,通过RT-PCR扩增Sj32抗原编码基因;将该基因克隆至原核表达载体pET28α,构建重组质粒pET28α-Sj32并转化大肠埃希菌BL21(DE3),经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达后用SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行分析和鉴定。结果RT-PCR扩增出1270bp的Sj32基因;双酶切和PCR鉴定证实Sj32基因成功插入pET28α中,SDS-PAGE分析显示表达产物为分子质量单位约为42ku的重组蛋白,与预期结果一致,表达的蛋白约占菌体总蛋白的24%;Western blot鉴定重组蛋白能被日本血吸虫感染的兔血清识别。结论成功构建了日本血吸虫重组质粒pET28α-Sj32,该质粒在大肠埃希菌BL21中获得了高效融合表达,表达的融合蛋白具有抗原特异性。

TAT-β-半乳糖苷酶对小鼠生物膜穿透性的研究

为寻找介导外源蛋白质进入组织细胞的生物学方法 ,本研究构建了pET2 8a TAT LacZ重组表达子 ,纯化得到TAT β Gal融合蛋白 ,通过腹腔注射到小鼠体内观察TAT β Gal能否穿过各组织生物膜及达到各组织的时间、浓度。结果发现TAT β Gal在短时间内可到达各组织。该研究证明在生物大分子的N 末端加上TAT具有穿透力的蛋白转导区肽段形成的融合蛋白可穿过生物膜到达各组织 ,这一发现为肽类。

耐高温葡萄糖异构酶的全细胞固定化条件研究

对三羟甲基磷交联Thermus oshimai葡萄糖异构酶重组菌的固定化工艺进行研究。确定所用硅藻土载体粒径36.8μm、聚凝剂聚乙烯亚胺分子质量为70 000 Da、交联剂合成前体为四羟甲基硫酸磷;运用最优的固定化条件:0.3 g硅藻土、5 mmol/L Mn^(2+)、0.12%(体积分数)聚乙烯亚胺絮凝1 h、1.5%(体积分数)三羟甲基硫酸磷交联1.5 h,所制备的固定化细胞酶活可达138.4 U/g。应用该催化剂于85℃和1 100 mmol/L D-葡萄糖底物条件下连续催化10批次,催化剂仍保留91%以上酶活,D-果糖转化率始终维持在51.7%以上。该工艺可以连续生产高果糖浓度高果糖浆,有效简化后续分离提取工艺,为进一步使用符合食品工业要求的表达系统连续制备高果糖浆奠定基础。

HPV16 E6基因在大肠杆菌中的表达

在大肠杆菌中表达HPV16 E6重组蛋白.利用自行构建的重组质粒pET28a(+)-HPV16 E6,经IPTG诱导表达HPV16 E6重组蛋白.实验结果表明,重组质粒pET28a(+)-HPV16 E6在大肠杆菌中经IPTG诱导成功表达出HPV16 E6重组蛋白.HPV16E6重组蛋白的制备为宫颈组织中HPV16型感染的早期诊断和宫颈癌治疗性疫苗的研制奠定了物质基础.

日本血吸虫谷胱甘肽硫转移酶原核表达载体的构建及序列分析

为构建带有组氨酸标签(his-tag)的日本血吸虫谷胱甘肽硫转移酶(sjGST)表达载体。以载有sjGST基因的载体PGEX-KG为模板,PCR扩增sjGST基因,并在进行酶切和基因测序后将其克隆到pET28a载体上。运用生物学软件与具有代表性的血吸虫GST基因进行比对并对可能的表达产物进行分析。结果表明,PCR产物与3种sjGST基因有99%的同源性。重组载体构建成功。