Caspase 3在大肠杆菌E.coliBL21中表达和活性的研究

目的:研究凋亡蛋白酶Caspase 3在大肠杆菌中的表达及活性。方法:用PCR法扩增出Caspase3基因cDNA,然后插入pCMV-Myc载体,扩增后克隆至表达载体pGEX-6p,使用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导Caspase 3蛋白的表达;应用SDS-PAGE和W estern b lot法鉴定其性质。结果:经测定诱导3 h后Caspase 3活性最高。结论:可在大肠杆菌E.coliBL21中诱导表达出有活性的Caspase 3,为研究其在细胞凋亡中的作用奠定了基础。

伊氏锥虫微管结合蛋白p15基因的分子克隆与表达

根据报道的布氏锥虫(Trypanosoma brucei)微管结合蛋白p15(Tb-MAPp15)基因及其3′非翻译区保守序列设计引物,采用PCR法从伊氏锥虫云南水牛株(Trypanosoma evansi stock YNB)基因组DNA中克隆得到伊氏锥虫微管结合蛋白p15(Te-MAP p15)基因。克隆片段长273bp,编码90个氨基酸,预测分子量9.0kDa。经同源性比较,所得基因与Tb-MAP p15基因同源率达到94%。抗原性分析Te-MAP p15基因表达的氨基酸序列比T.brucei微管结合蛋白p15多5个,均参与组成其中1个抗原决定簇,并且此抗原决定簇序列形成在蛋白中常作为识别位点的α螺旋。将该基因亚克隆到pGEX-6P-1原核表达载体,转化大肠杆菌E.coli RS21宿主菌,经IPTG诱导,可成功表达。重组融合蛋白大小为35kDa,与预期大小一致,经SDS-PAGE和Western-blot鉴定为重组伊氏锥虫微管结合p15蛋白。

豚鼠衣原体GPIC0474多克隆抗体制备

目的对GPIC0474进行克隆、重组、表达并制备GPIC0474的多克隆抗体,鉴定GPIC0474是否与其相似基因肺炎衣原体包涵体膜蛋白CPn0308具有相似的定位。方法通过PCR扩增GPIC0474,构建pGEX-6P2-GPIC0474重组质粒并转化,筛选阳性克隆提取质粒进行测序分析。对重组质粒进行诱导表达,以GST-GPIC0474为免疫原,对Balb/C小鼠进行常规免疫,分离血清获得多克隆抗体。结果成功制备了GPIC0474的多克隆抗体。结论试验所制备的GPIC0474的多克隆抗体为研究GPIC0474的定位提供了材料,进而为以后研究GPIC0474的功能奠定了基础。

TRPV4原核表达纯化系统的构建及生物信息学分析

目的:构建非选择性阳离子通道蛋白TRPV4的原核表达纯化系统,并对其进行生物信息学分析,为与该目标蛋白相关疾病的研究和药物活性成分筛选提供技术支持。方法:将人源TRPV4基因分别克隆至pET-28a(+)、pET-32a、pET-15b、pGEX-5X-1、pEX-4T和pGEX-6p-1等6种表达载体,并利用BL21和Rossetta两种大肠杆菌表达宿主构建TRPV4原核表达系统。采用谷胱甘肽亲和层析和镍柱亲和层析法分离纯化目标蛋白。通过生物信息学技术对目标蛋白进行分析,获得其相应的理化性质和结构参数。结果:利用pGEX-6p-1载体和Rossetta构建了GST-TRPV4和GST-TRPV4-6his融合蛋白原核表达系统。诱导表达目标蛋白的IPTG浓度为0.6 mmol/L时,GSTTRPV4融合蛋白有明显表达,IPTG浓度为0.4 mmol/L时,GST-TRPV4-6his融合蛋白有明显表达,表达温度均为18℃。纯化GST-TRPV4-6his融合蛋白时,咪唑溶液在100 mmol/L或200 mmol/L时可以得到完整的GSTTRPV4-6his融合蛋白。结论:本文首次在原核表达系统中成功构建和表达纯化了人源TRPV4离子通道蛋白,并利用生物信息学分析解析了该蛋白的理化性质,为后续高纯度大量表达和进一步研究奠定了良好的基础。

转录因子CSL-GST融合蛋白表达载体的构建及其表达纯化

目的构建转录因子CSL的GST原核表达载体pGEX-6p-1-CSL,并检测其在原核生物大肠杆菌中的表达。方法通过反转录及聚合酶链反应从人胰腺癌细胞系Hpac细胞中获得编码CSL的cDNA,定向克隆至C端带GST蛋白标签序列的原核表达载体pGEX-6p-1中,原核表达的GST-CSL蛋白经Gluta-thione-Sepharose 4B和PreScission蛋白酶纯化后用凝胶迁移实验分析其活性。结果 pGEX-6p-1-CSL经原核表达及纯化后得到了纯化的CSL蛋白。结论成功构建了转录因子CSL的GST原核表达载体PGEX-6p-1-CSL。

狂犬病病毒N、G两种蛋白在间接ELISA方法中的应用比较

目的比较狂犬病N、G两种蛋白检测抗体效果。方法本研究先通过比较pET-32a(+)和pGEX-6P-1两种载体表达的狂犬病病毒G蛋白和N蛋白,采用碳酸盐纯化表达量高的两种蛋白,再以纯化的抗原用于检测93份免疫犬血清。结果 (1)以pGEX-6P-1为载体的N、G两种蛋白表达量较高。(2)碳酸盐包被液可以得到纯度较高的蛋白。(3)间接ELISA检测93份抗体,其中56份G蛋白高于N蛋白,37份N蛋白高于G蛋白。(4)血清样本检测结果都为阳性,表明免疫效果良好。结论针对N、G两种蛋白的抗体在动物体内出现时间不同,哪种抗体出现的早,有待于我们进一步研究。

钙调蛋白镁结合位点突变体载体的构建、表达纯化及鉴定

目的构建钙调蛋白3种镁离子结合位点突变体的质粒载体,并进行表达纯化及鉴定,为深入研究钙调蛋白的生物学功能奠定基础。方法利用钙调蛋白cDNA进行点突变,制备3种镁离子结合位点突变的cDNA。将突变后的cDNA分别插入pGEX-6P-3载体,制备钙调蛋白突变体载体质粒。质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞,培养大肠杆菌,并诱导GST融合蛋白表达。利用Glutathione-Sepharose 4B珠子和PreScission蛋白酶分离纯化蛋白。结果酶切鉴定和DNA测序证实成功构建钙调蛋白突变体质粒;表达纯化得到的钙调蛋白突变体经电泳图鉴定纯度较高,浓度约1.0mg/mL。结论本研究成功构建了钙调蛋白镁结合位点突变体融合蛋白原核表达质粒,分离纯化可获得较高浓度较高纯度的钙调蛋白突变体。

梅花鹿鹿茸S100A4融合蛋白在大肠杆菌中的表达纯化

我们的前期研究表明,鹿茸发生和再生都是依赖干细胞的过程。鹿茸的干细胞存在于鹿未来鹿茸发生区的骨膜中,即生茸骨膜。AP细胞表达特有的分子S100A4,推测为鹿茸发生的关键调节分子。进一步从分子水平阐述S100A4在鹿茸发生中的调节机制需要高质量S100A4的纯品。为了解决这一问题,我们针对已从梅花鹿AP细胞反转录出的S100A4基因序列,设计了含有EcoR I和BamH I酶切位点的上下游引物,并扩增出了目的片段。其后将S100A4基因片段和PGEX-6P-1载体酶切并进行了连接,转入Top10F’感受态细胞中,涂板筛选出了阳性克隆,进行了菌液PCR及双酶切鉴定,再将重组质粒转入了BL21(DE3)pLys S表达菌株进行了IPTG诱导表达。用聚丙烯酰胺凝胶电泳及western blot鉴定表明融合蛋白成功表达,随后对融合蛋白进行了纯化。本研究成功地实现了鹿本身特有的S100A4基因的体外表达。

结核分枝杆菌蛋白Rv2986c的生物信息学分析及原核表达

目的分析结核分枝杆菌蛋白Rv2986c的结构与功能,并进行原核表达。方法从NCBI Genbank数据库获取Rv2986c蛋白氨基酸序列,利用ExPASY ProtParam、Protscaleon expasy、TMHMM Server v.2.0以及SOPMA等软件对Rv2986c蛋白的生物学性质进行分析。用pGEX-6p-1-Rv2986c重组质粒转染大肠埃希菌(E.coil)BL21(DE3)中表达Rv2986c,并使用GST亲和层析柱进行纯化。结果结核分枝杆菌Rv2986c蛋白由214个氨基酸组成,分子式为C975H1707N319O266S1,等电点(pI)为11.95,属于稳定、亲水性蛋白,无跨膜区;二级结构α-螺旋(Hh)占51.40%,无规则卷曲(Cc)占35.05%。重组质粒pGEX-6p-1-Rv2986c转染DE3后表达相对分子质量约为51×10^3的重组蛋白Rv2986c,经GST亲和层析柱纯化得到单一电泳条带的目的蛋白。结论生物信息学方法预测了结核分枝杆菌Rv2986c为无跨膜区的亲水性蛋白,并得到高纯度的重组目的蛋白Rv2986c,为Rv2986c的结构与功能研究奠定了基础。