重组人TGF-β1融合蛋白的克隆、表达、纯化及鉴定

目的构建人转化生长因子-β1(TGF-β1)基因的原核表达载体,表达并纯化GST-hTGFβ1.方法应用RT-PCR获得人TGF-β1的基因片段,成功构建人TGF-β1原核表达载体,诱导表达人TGF-β1与GST的融合蛋白;应用亲和层析法纯化重组融合蛋白,对纯化产物进行SDS-PAGE电泳分析和Western Blot检测分析.结果成功构建了人TGF-β1重组融合表达质粒pGEX-4T-1-TGF-β1,表达的蛋白经SDS-PAGE电泳分析,在Mr约为39×103处出现了一条新生的蛋白条带,该表达蛋白具有与TGF-β1抗体特异性的结合能力.结论成功构建了人TGF-β1基因的原核表达载体并纯化了该基因的原核表达产物,为下一步的人TGF-β1自体疫苗的研制奠定了基础.

重组蛋白Cox7a2原核表达及鉴定

目的:从原代培养的小鼠睾丸Leyd ig细胞中克隆Cox7a2基因,构建pGEX4T-1-Cox7 a2载体,表达和鉴定重组蛋白。方法:应用RT-PCR方法从原代培养的小鼠睾丸Leyd ig细胞中克隆Cox7 a2,利用BamH I和EcoR I酶切位点把Cox7a2克隆到pGEX4T-1载体,酶切和测序鉴定后,诱导重组蛋白的表达,进行纯化后,利用蛋白免疫印迹进行鉴定。结果:从原代培养的小鼠睾丸Leyd ig细胞克隆到Cox7a2完整的编码序列,构建了pGEX4T-1-Cox7 a2载体,表达了预期相对分子质量的融合蛋白,并经免疫印迹检测鉴定。结论:成功克隆Cox7a2,表达纯化了其融合蛋白,为基因的功能研究奠定了前期基础。

牛金属硫蛋白素bMTcin编码区的克隆及其在大肠杆菌中的表达研究

以本实验室由RT—PCR扩增得到的含有牛金属硫蛋白(bMT)cDNA的重组质粒pYJ101为模板,PCR扩增出牛金属硫蛋白素bMTcin的编码区,将其克隆到pGEM—T载体上并进行DNA序列测定。利用融合表达载体pGEX4T—1,在E.coli中诱导表达bMTcin,经过Glutathine Sepharose 4B亲和层析纯化后,SDS—PAGE检测GST:bMTcin的条带。结果表明,所克隆的bMTcin序列全长为141bp,其DNA序列与原模板中的序列完全相同,与GenBank中另外5个bMTcin DNA相比,第31位和86位与Conneely的序列为A和G,导致第11位(Thr)和29位(Arg)的氨基酸不同于其他4个序列(11位为Ala,29位为Lys)。融合表达产物亲和层析纯化后,用SDS-PAGE检测可见融合蛋白GST:bMTcin的条带,紫外分光光度计测定,融合蛋白GST:bMTcin的表达量大约为1.1mg/L发酵液。