PGL3-DF3-DTA特异性杀伤移植瘤裸鼠人乳腺癌细胞的实验研究

目的研究新构建的含人乳腺癌DF3启动子和白喉毒素A片段的重组表达载体PGL3-DF3-DTA对裸鼠人乳腺癌移植瘤的特异性杀伤作用。方法建立人乳腺癌移植瘤裸鼠动物模型,将4周龄裸鼠36只随机分为实验组、空载体组、空白对照组、阴性对照组4组,每组9只。将DF3阳性和阴性的人乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231分别接种于相应的裸鼠皮下。待成瘤后,将重组表达载体PGL3-DF3-DTA和PGL3-DF3多次、多位点注射入相应裸鼠移植瘤内。连续测量瘤体大小,计算瘤体体积。在不同时间点分批处死部分动物,行形态学观察、检测肿瘤细胞的凋亡,检测Ki-67,Bax及Bcl-2蛋白的表达。结果裸鼠人乳腺癌动物模型建立成功,经重组表达载体PGL3-DF3-DTA作用后的人乳腺癌细胞出现明显的凋亡现象,Ki-67及Bcl-2基因表达水平降低,Bax基因表达水平升高。结论重组表达载体PGL3-DF3-DTA能对DF3阳性的乳腺癌细胞产生特异性杀伤作用。

放疗联合pGL3/EGR1-Bax基因促进肺癌H460细胞凋亡及Bax基因表达的研究

目的探讨重组质粒pGL3/EGR1-Bax基因联合放射治疗对肺癌H460细胞的凋亡作用及对Bax基因表达的影响。方法将pGL3/EGR1-Bax质粒转染肺癌H460细胞,分组进行射线照射。RT-PCR检测各组细胞Bax基因的表达,蛋白免疫印迹检测Bax蛋白的表达;用流式细胞仪检测各组H460细胞凋亡情况。结果经酶切鉴定pGL3/EGR1-Bax重组质粒构建正确,基因联合放疗能促进Bax基因及蛋白的表达(与对照组比P<0.01,与空载体放疗组比P<0.05);基因放射治疗组H460细胞凋亡率明显高于对照组及空载体放疗组(P<0.01,P<0.05)。结论射线可通过诱导pGL3/EGR1-Bax重组质粒中Bax基因在肺癌H460细胞表达增强,从而显著提高H460细胞的凋亡率,为临床肺癌的基因放射治疗奠定实验基础。

pGL3-EPO-α-MHC启动子荧光素酶报告基因质粒的构建及缺氧调控功能考察

目的考察EPO-α-MHC启动子在缺氧条件下的调控表达作用。方法构建pGL3-EPO-α-MHC启动子编码荧光素酶报告基因的质粒,以含pGL3-EPO-α-MHC和pGL3-CMV启动子的质粒分别转染缺氧和常氧的心肌细胞(H9C2),检测荧光素酶的表达。结果 pGL3-CMV启动子质粒在缺氧条件下的报告基因表达与常氧条件相比显著下降(P<0.05),而pGL3-EPO-α-MHC启动子在缺氧条件下能够显著上调报告基因的表达4.3倍(P<0.01)。结论 EPO-α-MHC启动子具有缺氧调控功能。

人牙成釉细胞相关蛋白启动子的克隆和转录活性分析

目的:构建人牙成釉细胞相关蛋白(odontogenic ameloblast-asssociated protein,ODAM)基因不同长度的上游启动子荧光素酶报告基因载体,比较不同的启动子片段在成釉细胞、Hela细胞中的活性,为进一步判定上游启动子的转录调控区奠定基础。方法:以PCR方法获取基因上游启动子片段,将其构建至报告基因载体pGL3-Basic中,瞬时转染成釉细胞及Hela细胞,通过检测荧光素酶活性来分析启动子区域的转录调控能力。结果:成功地获得了不同长度的ODAM基因启动子目的片段,酶切鉴定表明不同长度启动子荧光素酶报告基因载体构建成功,不同长度的启动子在不同的细胞中活性不同,-333～-195与-195～-96区域为特异的转录调控作用区。结论:初步确定了ODAM基因启动子的转录活性区,为进一步研究该基因转录调控特点奠定基础。

细胞自身分化抗原-1启动子区域的克隆及其特性分析

目的:克隆不同长度的细胞自身分化抗原-1(CDA1)启动子区域并测定它们的活性,为进一步研究不同长度细胞自身分化抗原-1启动子(CDA1P)区域的功能打下基础。方法:以小鼠肝脏的全基因序列为模板,用PCR方法获得不同长度的目的片段,连接到pGL3-basic真核表达载体(pGL3-basic-mCDA1P),纯化pGL3-basic mCDA1P质粒后,瞬时转染到Leuwis肺癌细胞和单核巨噬细胞(RAW264.7),48 h后收集转染细胞,测定萤光素酶活性,明确不同长度的CDA1P的活性。结果:①通过PCR法成功获得不同长度的CDA1PDNA片段,并用酶切法证实;②成功构建携带有CDA1P的pGL3-basic真核表达载体,并通过酶切法及测序证实;③转染Leuwis肺癌细胞和单核巨噬细胞后测定萤光素酶活性发现不同长度的CDA1P活性不同,相同长度的CDA1P在Leuwis肺癌细胞和单核巨噬细胞中活性亦不相同。结论:CDA1P在不同细胞中活性可能存在差异。

萤火虫荧光素酶报告基因重组逆转录病毒载体的构建及鉴定

目的构建含萤火虫荧光素酶报告基因的逆转录病毒载体,为进一步研究生物发光活体动物体内光学成像奠定基础。方法利用重组DNA技术,将荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic双酶切得到的目的基因fluc+亚克隆至逆转录病毒载体pLXSN中,重组质粒pL(fluc)SN在脂质体介导下"乒乓"转染GP+E86和PA317包装细胞,G418筛选,直至出现抗性克隆。扩大培养,测定病毒滴度,并检测荧光素酶活性。结果经限制性酶切分析鉴定,载体插入基因大小、位置均正确,并用GP+E86和PA317细胞进行包装、病毒滴度测定、筛选,建立具有较高滴度的重组逆转录病毒fluc细胞系,该细胞可高效表达荧光素酶。结论成功构建了重组质粒pL(fluc)SN,为标识干细胞进行基础研究提供了一种检测方法和平台。

人牙釉质蛋白Amelotin,Ameloblastin及Enamelin基因启动子的初步研究

目的分析人釉成熟蛋白(Amelotin,AMTN)、成釉蛋白(Ameloblastin,AMBN)与釉蛋白(Enamelin,ENAM)基因上游启动子序列,构建不同长度的基因上游启动子报告基因载体,为进一步判断启动子序列的转录调控区奠定基础。方法利用软件分析基因启动子序列,以PCR方法获取基因上游启动子片段,将其构建至报告基因载体pGL3-Basic中。结果成功地获得了不同长度的Amelotin,Ameloblastin及Enamelin基因启动子目的片段,酶切鉴定表明不同长度启动子荧光素酶报告基因载体构建成功。结论成功构建了不同长度启动子的pGL3-Basic荧光素酶报告基因载体,为进一步研究牙釉质蛋白基因启动子的转录活性及转录调控特点奠定基础。

人P21^WAF1/CIP1启动子荧光素酶真核表达载体的构建

目的:构建含人P21WAF1/CIP1基因启动子的表达载体pGL3-P21p。方法:以全血总RNA为模板,经RT-PCR扩增P21WAF1/CIP1基因启动子,并将其克隆到T-easy载体,测序分析,然后经酶切再克隆到pGL3-basic,构成重组真核表达载体pGL3-P21p。将pGL3-P21p转染到乳腺癌细胞株MCF7中,并检测细胞中荧光素酶的活性。结果:经测序、酶切等检测证实重组真核表达载体pGL3-P21p构建成功,荧光素酶活性检测显示P21WAF1/CIP1基因启动子对荧光酶基因表达起到了正调控作用。结论:P21WAF1/CIP1启动子荧光素酶真核表达载体的成功构建为进一步研究P21WAF1/CIP1基因启动子的表达调控奠定了基础。

人成釉蛋白基因的启动子活性区域分析

目的:构建人成釉蛋白(ameloblastin,AMBN)基因不同长度的上游启动子荧光素酶报告基因载体,比较不同的启动子片段在成釉细胞、Hela细胞中的活性。方法:以PCR方法获取基因上游启动子片段,将其构建至报告基因载体pGL3-Basic中,瞬时转染成釉细胞、Hela细胞,通过检测荧光素酶活性来分析启动子区域的转录调控能力。结果:成功地获得了不同长度的ameloblastin基因启动子目的片段,酶切鉴定表明不同长度启动子荧光素酶报告基因载体构建成功,不同长度的启动子在不同的细胞中活性不同,-424-267与-128-37区域为特异性转录调控作用区。结论:成功构建了不同长度的ameloblastin基因启动子的pGL3-Basic荧光素酶报告基因载体,初步确定ameloblastin基因启动子的转录活性区,为进一步研究ameloblastin基因转录调控特点奠定基础。

调控毛囊生长CCDC72基因启动子克隆及萤光素酶报告基因载体的构建

目的对新发现的调控毛囊生长相关的CCDC72基因启动子序列进行分析,克隆并构建不同长度启动子萤光素酶报告基因载体。方法运用在线软件Cister对CCDC72基因5’端2000bp进行启动子特征分析;以人毛乳头细胞基因组DNA为模板进行PCR扩增目并进行测序鉴定,再以扩增产物为模板PCR得到不同长度的启动子片段,并测序,将获得启动子片段插入pGL3-Basic载体。结果序列分析发现起始密码子ATG上游的-1^-200bp及-600^-1000bp的区域内存在多个顺式作用元件,成功获得1924bp扩增片段,并构建了4个不同长度的CCDC72启动子报告基因载体。结论上述载体的成功构建及序列分析为进一步研究CCDC72基因的启动子活性及基因表达调控奠定了基础。

人釉蛋白基因启动子在成釉细胞中的转录活性研究

目的构建人釉蛋白(Enamelin,ENAM)基因不同长度的上游启动子荧光素酶报告基因载体,通过分析不同的启动子片段的活性,确定启动子的功能区域,为进一步研究Enamelin基因的转录调控机制奠定基础。方法以PCR方法获取基因上游启动子片段,将其构建至报告基因载体pGL3-Basic中,瞬时转染成釉细胞及Hela细胞,通过检测荧光素酶活性来分析启动子区域的转录调控能力。结果成功地获得了不同长度的Enamelin基因启动子目的片段,酶切鉴定表明不同长度启动子荧光素酶报告基因载体构建成功,不同长度的启动子在成釉细胞中活性不同,-1216～-554与-312～-133区域为特异的转录调控作用区。结论成功构建了不同长度的Enamelin基因启动子的pGL3-Basic荧光素酶报告基因载体,初步确定Enamelin基因启动子的转录活性区,为进一步研究Enamelin基因转录调控特点奠定基础。

人釉成熟蛋白Amelotin基因的启动子活性区域分析

目的构建人牙釉质蛋白(Amelotin,AMTN)基因不同长度的上游启动子荧光素酶报告基因载体,比较不同的启动子片段在成釉细胞及Hela细胞中的活性,为进一步判定上游启动子的转录调控区奠定基础。方法以PCR方法荻取基因上游启动子片段,将其构建至报告基因载体pGL3-Basic中,瞬时转染成釉细胞及Hela细胞,通过检测荧光素酶活性来分析启动子区域的转录调控能力。结果成功地获得了不同长度的Amelotin基因启动子目的片段,酶切鉴定表明不同长度启动子荧光素酶报告基因载体构建成功,不同长度的启动子在不同的细胞中活性不同,-190～-358与-35～-93区域为特异的转录调控作用区。结论成功构建了不同长度的Amelotin基因启动子的pGL3-Basic荧光素酶报告基因载体,初步确定Amelotin基因启动子的转录活性区,为进一步研究Amelotin基因转录调控特点奠定基础。

GDF5基因启动子表达载体的构建

目的构建含人生长分化因子5(GDF5)基因启动子表达载体pGL3-GDF5,为研究GDF5在骨骼、肌肉发育的作用机制提供实验基础。方法扩增人GDF5基因启动子序列,克隆至pGL3-Basic表达载体并转化入大肠杆菌DH10b,双酶切鉴定并测序。结果 PCR扩增后的产物在约854 bp处出现明显的特异性条带,酶切鉴定结果与理论预测值一致,测序未出现碱基突变。结论成功构建了含GDF5基因启动子的表达载体。

ID1启动子的构建及其在不同细胞系中的表达

目的观察不同细胞系中ID1启动子活性的表达的不同。方法以大鼠的基因组DNA为模板克隆了长度为1742bp(-1765/+88)的大鼠ID1启动子序列,将其连接到带有luciferase报告基因的PGL3-basic载体上,构建PGL3-ID1启动子序列。测序正确后,用磷酸钙共沉淀法转染大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)、A549细胞、F10细胞、MEF细胞和MC3T3细胞。转染36h后,收取细胞应用荧光素酶报告基因系统检测PGL3-ID1报告基因的表达。结果构建成功的PGL3-ID1启动子在A549细胞、F10细胞、MSCs细胞、MEF细胞中的表达明显增高,尤以A549和F10的表达最为显著;在MC3T3细胞中表达不明显。结论 ID1启动子的活性与细胞的分化程度密切相关,可能对细胞的增殖和分化起了关键性的调控作用。

HBV启动子克隆及萤光素酶报告基因载体的构建

目的对HBV启动子基因序列进行分析,克隆并构建S1、S2、ENⅠ/X及ENⅡ/C 4个启动子的萤光素酶报告基因载体。方法用pHBV 1.3作为模板进行PCR扩增目的片段,将获得片段与pGL3-Enhancer荧光素酶报告载体重组构建,分别转染Huh7细胞后,检测萤光素酶活性。结果成功获得121 bp、368 bp、437 bp、237 bp 4个目的扩增片段,并成功构建了S1、S2、ENⅠ/X及ENⅡ/C启动子报告基因载体。结论上述载体的成功构建及初步分析为进一步研究HBV启动子活性及新的抗HBV药物奠定了基础。

带新霉素抗性的萤光素酶报告载体的构建

目的:构建带新霉素抗性的萤光素酶报告载体。方法:设计扩增新霉素抗性基因neo,克隆入萤光素酶报告载体pGL3,得到pGL3-neo。分别比较pGL3、pGL3-CMV promoter瞬时转染组和经G418筛选的pGL3-neo、pGL3-neo-CMV promoter稳定转染组细胞萤光素酶活性。结果:PCR扩增出neo表达单元;酶切和DNA测序分析鉴定得到带新霉素抗性的萤光素酶报告质粒pGL3-neo。G418筛选可获得稳定转染pGL3-neo细胞株和稳定转染pGL3-neo-CMV promoter的细胞株。荧光检测显示:瞬时转染pGL3组、pGL3-CMVpromoter组及稳定转染pGL3-neo组、pGL3-neo-CMVpromoter组萤光素酶活性值分别为1047±86、1504±107和34819±1479、456109±15791,稳定转染组萤光素酶活性均高于瞬时转染组,P<0.05。结论:成功构建了带新霉素抗性的萤光素酶报告基因载体,使报告基因检测数据的敏感性和可靠性显著提高。

硒对乳腺癌细胞株p21^(WAF1/CIP1)启动子的调控作用

目的:研究硒对p21的转录调控及其调控位点。方法:通过向转染了重组质粒pGL3-p21p的乳腺癌细胞株MCF7先后加入不同的p21因子启动子的负调节因子和乳酸硒,对比分析荧光素酶表达活性,以确定硒对p21的转录调控及调控位点,并验证硒对癌细胞的生长的负调控作用。结果:perifosine、depsipeptide、apicidin、butyrate与硒共同诱导荧光素酶,酶活性表达无显著差异;而C-Myc与醋酸硒先后诱导酶活性表达差异显著。结论:硒对癌细胞具有诱导凋亡的作用,转录调节位点在p21启动子的sp1结合位点。

pGL3-BMP2荧光素酶报告基因载体的构建及鉴定

目的扩增BMP2基因下游110kb处的预测有增强子功能的非编码序列,将其插入pGL3-promoter载体,构建该长片段的真核表达系统。方法在所设计的上下游引物的5’端加入BamHⅠ酶切位点,采用聚合酶链反应(PCR)的方法从短指畸形患者外周血提取的DNA中扩增BMP2基因下游区域预测有增强子功能的一段长约5kb的非编码序列。首先将扩增的目标片段与PGEM-T载体连接,连接产物转化DH5α感受态细菌,经蓝白斑筛选出的阳性克隆通过电泳、酶切鉴定后进行测序验证是否为插入的目标序列,测序正确后提取重组质粒。利用限制性内切酶BamHⅠ同时酶切插入目标序列的质粒和pGL3-promoter载体,将酶切完全的目标序列与线性pGL3-promoter空质粒载体在Solution I快速连接酶的作用下进行连接反应,构建目标序列的真核表达载体。结果经过酶切和测序证实含有4.8kb长的目标序列的分子克隆和真核表达载体构建成功。结论实验成功克隆了BMP2基因下游区域预测有增强子功能的一段长约5kb的非编码序列,并构建了pGL3-promoter-enhancer真核表达载体,为进一步验证该序列可能的调控功能奠定了基础。

含hITF启动子的荧光素酶报告质粒的构建及活性检测

目的构建含有人肠三叶因子(intestinal trefoil factor,hITF)启动子的荧光素酶表达载体,并检测启动子活性。方法采用PCR技术从LS-174T细胞基因组DNA中扩增出长约2.5kb的含hITF基因启动子片段(-2331/+53),而后在此基础上构建了10个不同长度的启动子序列至pGL-3basic荧光素酶表达载体,然后将这些重组质粒转染HEK-293细胞并在48h后检测其荧光素酶活性。结果插入的hITF启动子片段测序结果显示正确,-500/+53,-400/+53和-300/+53片段活性介于0.023～0.026之间,-200/+53,-100/+53和-50/+53活性介于0.0032～0.0042之间,明确了最小活性功能域位于-300/+53区域,-300/-200区域对hITF转录起始起关键性作用。结论成功构建了含hITF启动子的萤火虫荧光素酶报告基因质粒,鉴定出人肠三叶因子(hITF)启动子活性位于-300/-200区域。

骨桥蛋白启动子区报告基因的构建

目的 克隆和构建带人骨桥蛋白（OPN）启动子区基因的载体pGL3-OPN.方法 一步法提取人脐静脉内皮细胞（HUVEC）总DNA,PCR扩增 OPN全长基因,克隆入T载体,测序,双酶切连入真核表达载体pGL3-vector,酶切鉴定.将构建好的pGL3-OPN瞬时转染到人乳腺癌细胞MDA-MB-435中,利用双荧光素酶报告基因检测试剂盒进行检测,通过计算两种质粒荧光素酶活性的比值来筛选药物.结果 扩增出人OPN基因全长,测序结果和GenBank记载一致,成功克隆入真核表达载体.p47可一定程度激活OPN启动子活性.结论 成功构建带有人OPN基因的真核表达载体pGL3-OPN.