苏云金芽胞杆菌基因组研究

苏云金芽胞杆菌制剂是目前世界上产量最大、使用最广的微生物杀虫剂。近年来,国内外研究人员在苏云金芽胞杆菌的功能基因组学领域开展了深入的研究,取得了丰硕的研究成果。本文拟就苏云金芽胞杆菌的基因组、转录组、蛋白质组及代谢组研究进展进行简要论述。

靶向bcl-2基因短发卡RNA干扰真核质粒表达稳定株筛选和建立

目的构建针对bcl-2基因的短发卡RNA(shRNA)干扰真核质粒表达载体,转染到bcl-2基因高表达的胃癌细胞株SGC-7901中,并筛选出稳定低表达bcl-2基因的细胞株。方法针对bcl-2基因的mRNA序列设计、合成4对寡核苷酸序列,插入质粒载体pGPH1/GFP/Neo中,经脂质体介导转染SGC-7901细胞。RT-PCR检测bcl-2基因在mRNA水平的变化,MTT法检测bcl-2基因沉默后胃癌SGC-7901细胞的增殖情况。基因沉默效果最好的一组,经G418筛选以得到稳定表达株。结果与对照组相比,转染成功后的细胞bcl-2基因在mRNA水平均显著下降,细胞增殖速度明显降低(t=2.41,P<0.05);并筛选出稳定表达shRNA2质粒的阳性克隆。结论本研究成功利用针对bcl-2基因的shRNA质粒载体筛选出稳定低表达bcl-2基因的SGC-7901细胞,为胃癌的基因治疗研究奠定了基础。

菌落PCR产物直接测序方法的建立及在水稻基因测序中的应用

建立了以菌落PCR产物作为DNA测序模板进行快速测序的技术方法。研究结果表明,采用菌落PCR技术,以载体插入位点两端序列互补的通用引物(如M13正反向引物)为引物,在控制菌落PCR反应条件的情况下,不仅可用于筛选和鉴定阳性克隆,而且菌落PCR产物还可作为DNA测序模板,结果准确可靠。与常规质粒测序方法比较,该法快速、简便,但对具有PolyT、PolyA过多的序列进行测序时,该法测序效率较低。

BDNF的酵母双杂交诱饵载体的构建和初步鉴定

目的：构建和转化脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)的酵母诱饵重组质粒,为通过酵母双杂交研究BDNF的功能及作用机制奠定基础。方法：用PCR扩增BDNF基因cDNA中编码完整开放阅读框的基因片段；将该基因片段与plexA载体定向重组；用酶切和测序鉴定重组质粒；将核苷酸序列正确的重组质粒转化人EGY48(p8op-LacZ)酵母菌株。结果：成功构建pLexA-BDNF重组质粒。转化有重组质粒和pLexA空载体的两种EGY48(p8Op—LacZ)酵母都能在SD／Gal／Raf／-His／-Ura培养基中长成白色菌落(同时,转化pLexA-pos阳性对照质粒的酵母菌在相同条件下长成蓝色菌落),但都不能在SD／-His／-Leu／-Ura培养基中生长,在SD／-His／-Ura液中培养16h后,OD_(600)均值均为0.9±0.1。这表明重组质粒表达的融合蛋白没有激活LEU2和lacZ酵母报告基因表达的活性,电没有酵母毒性作用。结论：构建的诱饵重组质粒可以用于下一阶段的人胎脑cDNA文库筛选。

抗α毒素单链抗体基因表达载体的构建

将 2种抗A型产气荚膜梭菌α毒素单链抗体 (ScFv)基因ScFv - 2E3和ScFV - 1A8分别克隆至表达质粒pUC119,pET - 2 0b ,pET - 2 8a和pHOG2 1中 ,构建了重组质粒PUC -2E3和pUC - 1A8,pET2 0b - 2E3和pET2 0b - 1A8,pET2 8a - 2E3和pET2 8a - 1A8以及pHOG - 2E3和pHOG - 1A8,然后分别转化至大肠杆菌中 ,提取质粒 ,并进行酶切鉴定和核苷酸序列分析 ,结果表明构建的重组质粒中均含目的ScFv基因片段 ,说明已成功构建了

超螺旋PGEM-1重组质粒的提取、纯化与鉴定

本文采用Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ２Ｂ层析法去除粗提物中的ＲＮＡ，用０．７％低融点琼脂糖凝胶回收超螺旋质粒，使质粒的纯化过程费时较少且获得令人满意纯度的超螺旋质粒。

家蚕微孢子虫SWP25基因BmN细胞表达质粒的构建及表达

本研究旨在构建含家蚕微孢子虫孢壁蛋白基因SWP25的家蚕卵巢细胞(BmN)表达质粒,检测该基因在宿主细胞中的表达,为在细胞水平筛选与家蚕微孢子虫孢壁蛋白SWP25相互作用的宿主蛋白奠定基础。利用家蚕核型多角体病毒Bac-to-Bac表达系统,将家蚕微孢子虫孢壁蛋白基因SWP25和报告基因EGFP克隆到杆状病毒转移载体pFast Bac1中,转化BmDH10Bac感受态细胞并筛选阳性重组质粒用于转染BmN细胞。经PCR技术鉴定,成功获得重组杆状病毒质粒v BmEGFP-SWP25。在转染成功的细胞中可观测到绿色荧光信号。使用Western blot方法在感染重组病毒的家蚕BmN细胞中检测到大小约55 000的重组蛋白条带,与理论值一致,表明家蚕微孢子虫孢壁蛋白基因SWP25在BmN中成功表达。

禽流感DNA疫苗和转移因子联合免疫效果研究

为研究禽流感DNA疫苗和转移因子联合免疫的免疫增强效果,试验用DH5α工程菌增殖的重组质粒pCAGGoptiHA5和转移因子联合免疫SPF鸡(转移因子采用口服和注射两种方式进行协同免疫),免疫后不同时间监测各组免疫鸡只的免疫器官指数、血清HI抗体水平变化情况。结果表明:联合免疫试验组抗体水平显著高于DNA疫苗单独免疫组,联合免疫组鸡只的法氏囊、胸腺和脾脏免疫器官指数均显著增加(P<0.05),但转移因子的口服和注射两种免疫方式之间差异不显著(P>0.05)。说明禽流感DNA疫苗和转移因子联合免疫协同作用显著。

改良头孢西丁平板试验检测大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌质粒介导的AmpC酶

目的依据EDTA可渗透菌细胞内并促进β-内酰胺酶释放至外环境的原理,建立并评价检测大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌质粒介导的AmpC酶的改良头孢西丁平板试验（MCAM）。方法于含有2、4、6、8μg/ml的头孢西丁平板上接种过夜培养的大肠埃希菌ATCC25922,然后用直径5mm的打孔器在琼脂表面均匀间隔打孔,于孔中分别加入0.5mol/LEDTA0、3、5、7、10μl（使孔中约含EDTA分别为0、450、750、1000、1500μg）,各孔加待检菌悬液（〉1011CFU/ml）25μl,35℃过夜培养。以孔周有细菌生长环为AmpCs阳性。以阴沟肠杆菌029M和大肠埃希菌ATCC25922作质控,用MCAM和酶粗提物三维试验（TDEM）同时检测临床分离的头孢西丁不敏感大肠埃希菌（14株）和肺炎克雷伯菌（13株）的AmpC酶,对两种方法进行比较。结果MCAM试验应用6μg/ml头孢西丁平板和750μgEDTA进行检测,其结果与TDEM试验完全一致。结论该方法操作简便、结果易于判读,在一块平板上可同时进行多株菌的检测,适于各级临床微生物实验室应用。