利用透明颤菌血红蛋白基因vgb改造毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K的研究

为了解决酵母发酵时贫氧限制目的蛋白表达量,利用透明颤菌血红蛋白基因vgb设计毕赤酵母分泌 型表达载体pPIC9K-vgb,并以人乳铁蛋白基因为目的基因转入毕赤酵母GS115。研究结果表明,该表达载体具 有转化操作简单、后期工程菌筛选简便、菌体耐低氧能力强、目的蛋白摇瓶表达量高等优点。该表达载体也可 以通过直接替换目的基因而用于其他蛋白表达系统的开发研究。

毕赤酵母中抗癌镇痛肽肺靶向融合体表达载体——穿梭质粒pPIC9K-RGD-4C-His Tag-AGAP的构建

采用PCR的方法对AGAP(anti-cancer analgesic peptide,抗癌镇痛肽)的N端进行了基因改造,保留了Kex2初步切割信号序列,去除了Ste13的切割序列,加入了对蝎毒蛋白抗癌镇痛活性无影响的氨基酸作为linker。通过构建辅助质粒pPIC6K,避免了kan基因内部的Xho I酶切位点对基因克隆的影响,构建了中介质粒pPIC6K-RGD-4C-His Tag-AGAP,该质粒经BamH I和EcoR I双酶切取得所需DNA片段,与同样经过双酶切的质粒pPIC9K进行连接,最终成功构建了酵母表达质粒pPIC9K-RGD-4C-His Tag-AGAP,测序结果表明,抗癌镇痛肽肺靶向融合体基因已成功插入到酵母表达载体pPIC9K中。

重组质粒pPIC9K-pZP3α-hCGβCTP^(109～145)的构建

目的 :为发展多特异性避孕疫苗 ,制备重组抗原pZP3α -hCGβCTP10 9～ 14 5,用基因工程技术构建重组质粒pPIC9K -pZP3α -hCGβCTP10 9～ 14 5.方法 :根据pZP3α全长和hCGβCTP10 9～ 14 5编码的DNA列设计两对引物 ,通过部分重叠聚合酶链式反应 (overlappingPCR) ,扩增出pZP3α -hCGβ -CTP10 9～ 14 5DNA片断 ,克隆到载体质粒pPIC9K中 ,然后导入大肠杆菌DH5α ,用PCR和双酶切反应鉴定重组质粒 ,并用DNA测序仪对重组质粒测序 .结果 :3步PCR扩增出pZP3α -hCGβ -CTP10 9～ 14 5DNA片段 ,插入到载体质粒pPIC9K的克隆位点 ,获得重组pPIC9K -pZP3α -hCGβ -CTP10 9～ 14 5表达质粒 ,测序结果显示插入序列与设计预期完全一致 .结论 :重组质粒pPIC9K -pZP3α -hCGβ -CTP10 9～ 14 5构建成功 ,为表达重组抗原pZP3α -hCGβ -CTP10 9～ 14 5。

重组质粒βhCG-pPIC9K的构建及嗜甲醇酵母(Pichiapastoris)的转化

目的 :为用基因重组技术表达hCG避孕疫苗抗原 ,构建在酵母细胞中表达的重组质粒βhCG -pPIC9K ,转化嗜甲醇酵母 .方法 :根据βhCG的cDNA序列设计两条引物 ,使上游带EcoRI酶切位点 ,下游带NotI酶切位点 ,以质粒 βhCG -PBSKS为模板 ,进行PCR扩增反应 ;将所得的DNA片段经EcoRI和NotI双酶切后用T4连接酶与pPIC9K质粒进行连接 ,然后导入大肠杆菌DH5α ,用PCR筛选阳性克隆并用双酶切鉴定重组子βhCG -pPIC9K .再用电打孔法转化酵母 (Pichiapastoris) ,用缺组氨酸MD平板筛选阳性株并在含G4 18的YPD培养基中筛选多拷贝插入菌株 .结果 :用所设计的引物扩增出两端分别带EcoRI和NotI酶切位点的βhCGDNA片段 ,插入pPIC9K并导入DH5α获得阳性克隆 ,经PCR反应和双酶切鉴定表明重组质粒是 βhCG -pPIC9K ,并转化嗜甲醇酵母获得耐受 4mg/mLG4 18的菌株 .结论 :构建了重组质粒 βhCG -pPIC9K并获得插入重组质粒 βhCG

Neuritin毕赤酵母表达系统的构建及其对PC12细胞的影响

旨在构建Neuritin的毕赤酵母表达系统获得大量有活性的Neuritin蛋白,研究其神经生物学功能。PCR扩增编码neuritin基因cDNA序列,并纯化回收,通过酶切和连接插入穿梭载体pPIC9K中,转化大肠杆菌DH5α,neuritin-pPIC9k重组质粒经PCR与测序鉴定后,使用SalⅠ酶切使其线性化,电击转化酵母菌GS115,经筛选与鉴定,成功构建了Neuritin的毕赤酵母表达系统。结果表明,使用甲醇诱导其表达,SDS-PAGE和Western blot分析得到11 kD的Neuritin蛋白,纯化的Neuritin蛋白加入PC12细胞培养液中,能促进其突起的生长。

超耐热酸性α-淀粉酶基因的克隆及其在酵母细胞中的表达

用PCR方法扩增来源于极端嗜热厌氧古菌Pyrococcus furiosus中的超耐热酸性α-淀粉酶的结构基因，将该结构基因引入载体pPIC9K中，将重组质粒pPIC9K—Amy转化大肠杆菌DH5α细胞，测序结果表明，克隆到的α-淀粉酶结构基因为1305bp，其编码的成熟肽为435个氨基酸。将正确构建的重组质粒转化毕赤酵母GS115细胞，得到酵母工程菌株。在酵母α-Factor及AOX1基因启动子和终止信号的调控下，超耐热酸性α-淀粉酶在甲醇酵母中大量表达并分泌到胞外，该酶的表达受甲醇的严格调控和诱导，随着诱导培养时间的增加，在培养基上清液中的单位体积酶活力相应上升，在诱导培养7d后酶活力达到最大值。该酶最适反应温度为90-100℃，最适反应pH值为4．5—5．5。该酶具有非常好的温度稳定性，在100℃条件下热处理5h。仍具有60％以上的酶活力。该酶的这些优点使其非常适于在工业生产上应用。

黑曲霉酸性α-淀粉酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

以黑曲霉Aspergillus niger基因组DNA为模板,PCR扩增出酸性α-淀粉酶的结构基因,将此基因插入载体pPIC9K,重组质粒pPIC9K-asAA转化毕赤酵母SMD1168,并通过G418平板培养基筛选高拷贝转化子。在酵母α-Factor及AOX1基因启动子和终止信号的调控下,酸性α-淀粉酶大量表达并分泌到胞外,该酶的表达受甲醇的严格调控和诱导,摇瓶培养中,2%甲醇诱导培养168h后酶活力达到最大值2838U/mL。SDS-PAGE结果显示该重组酶的分子质量为58kD。该酶的最适反应pH值为4.0,在pH3.0～6.0之间酶活力基本保持稳定,最适反应温度为70℃,在工业生产常用温度50℃条件下,该酶能够长时间保持稳定,并具有较高的酶活力。重组毕赤酵母遗传稳定性良好。

人巨细胞病毒重组基因表达质粒的构建

目的 用基因工程技术克隆人巨细胞病毒 (Humancytomegalovirus ,HCMV)中抗原性较强的蛋白片段—gp5 2C末端和pp15 0C末端的DNA序列 ,插入pPIC9K质粒 ,构建适于酵母表达系统的重组表达质粒。方法 根据人巨细胞病毒糖蛋白gp5 2和磷酸蛋白pp15 0C末端的cDNA序列 ,设计出 2对引物。利用PCR的方法 ,以病毒培养液上清为模板 ,进行二轮PCR扩增 ,把两个目的基因串联在一起 ,将所得的DNA片段经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切后用T4连接酶与pPIC9K质粒进行连接 ,然后导入大肠杆菌DH5α ,筛选出阳性转化子 ,并用PCR和双酶切鉴定阳性重组子。结果 从人巨细胞病毒培养液上清中扩增出目的基因 ,PCR反应和双酶切鉴定结果与预期相符。

草鱼生长激素基因在毕赤酵母中的表达

将草鱼生长激素基因(cGH)的cDNA亚克隆到酵母表达载体pPIC9K中,经电击转化导入毕赤巴斯德酵母GS115菌株,获得转化子。菌落PCR技术筛选证实cGH已经整合到了酵母染色体上。对重组酵母进行诱导表达,SDS-PAGE和Western印迹分析,结果表明cGH在毕赤巴斯德酵母GS115菌株中获得了高效表达。

毕赤酵母表达皮蝇素A蛋白

建立了用毕赤酵母表达系统表达皮蝇素A（Hypodermotin A，HA）的技术，并对表达条件进行了优化筛选。将皮蝇素A基因连接到质粒pPIC9k上，构建了重组转移质粒pPIC9k—HA。重组质粒通过电激转化入酵母细胞GS115后，用组氨酸缺陷培养基和G418分别进行筛选。重组酵母细胞在含0．5％甲醇的培养基中诱导产生目的蛋白，培养3d后收取上清，用阴离子交换层析柱分离纯化。经SDS—PAGE检测，所表达的蛋白相对分子质量约为30000。Western—blotting表明，该蛋白能与兔抗HA血清特异性结合。明胶电泳检测显示，该蛋白具有酶活性。单因素改变表达条件的结果表明，甲醇浓度在0．5％～1％、溶氧量在70％以上、诱导2～3d的情况下表达产量最高，达1500mg／L左右。该研究结果对防治牛皮蝇蛆痛疫苗的深入研究及毕赤酵母在寄生虫领域的应用有一定价值。

人甲状旁腺激素-血清白蛋白融合蛋白的构建及在毕赤酵母中的表达

利用重叠PCR技术拼接PTH和HSA基因,并将构建好的融合基因插入到载体pUC19测序后插入表达载体pPIC9K中,在启动子AOXⅠ和α交配因子信号肽的作用下,分泌表达融合蛋白PTH-HSA。重组质粒pPIC9K/PTH-HSA经SalI线性化后,电击转化毕赤酵母KM71,经G418筛选得到的转化子。PCR鉴定后,用甲醇诱导表达,蛋白电泳分析表明融合基因得到表达;Westernblot分析表明发酵液上清中表达的融合蛋白PTH-HSA具有HSA的抗原性:用酶标法测定发酵上清中融合蛋白的甲状旁腺激素活性为318IU/ml。

重组人血管内皮生长因子165在Pichia酵母中的表达

目的 :采用基因工程方法构建基因工程菌制备人VEGF1 65蛋白。方法 :自人肿瘤组织中获取人VEGF1 65cDNA ,构建pPIC9K酵母表达载体 ,采用Pichia酵母真核表达系统表达目的蛋白。结果 :SDS PAGE及Western blot结果显示目的蛋白已成功表达。结论 :在Pichia酵母中成功表达人VEGF1 65。

人成纤维细胞生长因子21基因的克隆及在毕赤酵母中的表达

目的:以毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115和SMD1168为宿主菌表达人源成纤维细胞生长因子21(hFGF21),为开发治疗糖尿病药物提供一定的实验基础。方法:根据毕赤酵母基因偏爱密码子和hFGF21氨基酸序列,设计多条寡核苷酸引物。利用融合PCR方法获得人工合成的成纤维细胞生长因子21(FGF21)基因,定向克隆到质粒pPIC9K中,电转化Pichia pastorisGS115和SMD1168。MD、MM平板筛选表型Mut+,YPD/G418平板进一步筛选高拷贝转化子。甲醇诱导表达,硫酸铵沉淀、分子筛、离子交换方法纯化目的蛋白。结果:PCR扩增出约569bp的特异性片段,测序分析正确;诱导表达上清经SDS-PAGE和Western blotting分析表明:FGF21在宿主菌GS115中不表达,而在SMD1168表达上清中出现相对分子质量为20000的特异性条带,且与抗FGF21抗体产生特异性反应,阴性对照在该处无特异性带,证明hFGF21蛋白在SMD1168菌株中成功分泌表达。结论:成功克隆FGF21基因,并在Picha pastorisSMD1168中获得表达。

重组水貂生长激素真核表达载体的构建及在巴斯德毕赤酵母中的表达

【目的】构建水貂生长激素(mGH)基因真核表达载体,并在巴斯德毕赤酵母GS115中进行表达,为大量获得水貂生长激素奠定基础。【方法】将体外合成的水貂生长激素基因插入分泌型表达载体pPIC9K。将重组的pPIC9K-mGH用SacI酶切后,LiC1法转化巴斯德毕赤酵母菌株GS115,经G418筛选后进行甲醇诱导表达,并以SDS-PAGE和Western blot检测酵母上清中水貂生长激素的表达。【结果】酵母上清中可见与目的蛋白相对分子量(31kd)相符的条带,该条带可被水貂生长激素多克隆抗体特异识别。【结论】正确构建了水貂生长激素真核表达载体,该蛋白能在巴斯德毕赤酵母中成功表达。

α-2b干扰素重组质粒的建立及在毕赤酵母中的表达

目的:采用基因工程手段构建基因工程菌表达α-2b干扰素。方法:根据毕赤酵母密码子嗜好性原理设计并合成α-2b干扰素基因序列,将其插入到毕赤酵母Pichia pastoris的分泌型表达质粒pPIC9K中,得到重组分泌表达质粒pPIC9K-IFNα-2b,并用电转化法转化P.pastoris GS115。筛选出整合型His+Muts菌株,进一步用G418筛选获得高拷贝转化子,经5d诱导表达后SDS-PAGE检测。结果:菌落PCR和序列测定结果显示重组表达质粒已成功构建,SDS-PAGE结果显示目的蛋白已成功表达。结论:在毕赤酵母中成功表达α-2b干扰素。

细胞因子midkine基因的克隆及其转化甲醇酵母Pichia pastoris

目的克隆细胞因子midkine(MK)基因,并转化甲醇酵母Pichia pastoris。方法利用RT-PCR方法从人胃癌MGC803细胞总RNA中扩增MK cDNA,构建分泌表达载体pPic9k-MK,然后转入宿主菌GS115中,提取GS115的基因组DNA,用PCR法扩增鉴定阳性克隆。结果成功构建了分泌表达载体pPic9k-MK,并转入GS115中,筛选到抗4.0 mg/mlG418的重组菌株,鉴定出5个阳性克隆。结论MK基因可以转入甲醇酵母Pichia pastoris中,为今后在Pichia pastoris中表达有活性的MK蛋白,并进一步研究其生物学功能和作用机制奠定了实验基础。

家蚕抗菌肽基因Cecropin-D的克隆及其真核表达载体的构建

从家蚕中提取总RNA,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,获得了家蚕Cecropin-D基因编码区的cDNA,扩增出家蚕抗茵肽Cecropin-D成熟肽基因片段,重组克隆入pMD18-Tvector载体,经DNA测序,该基因为186bp,编码62个氨基酸。用限制性内切酶切下目的基因,插入毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建真核表达栽体pPlC9K-CD。本实验的研究为获得超量表达的高活性表达抗菌肽Cecropin-D以及为研制具有抗菌活性的新型基因药物奠定了基础。

Neuritin在毕赤酵母中的分泌表达与鉴定

目的:构建Neuritin的毕赤酵母分泌表达系统,为进一步探讨Neuritin的生物学功能及作用机制奠定基础。方法和结果:在已克隆Neuritin cDNA的基础上,PCR扩增出Neuritin ORF与载体pPIC9k重组,然后利用电击转化将重组质粒pPIC9k-Neuritin导入GS115酵母菌株。筛选出阳性克隆经PCR及测序正确后,用甲醇诱导Neuritin分泌表达;表达产物经SDS-PAGE及Western-blot鉴定。结论:成功构建Neuritin的毕赤酵母分泌表达系统。

Gallinacin-2在毕赤酵母中的分泌表达

利用RT-PCR技术,从鸡肺脏总RNA中克隆了Gal-2 cDNA全序列,以克隆载体为模板PCR扩增Gal-2成熟肽cDNA,将成熟肽cDNA插入到分泌型表达载体pPIC9k中,构建pPIC9k-Gal-2成熟肽表达载体;通过电转化方法将表达质粒导入到毕赤酵母GS115体内,阳性克隆菌经甲醇诱导表达,SDS-PAGE蛋白电泳检测在3.9ku附近出现预期大小的条带,灰度扫描显示蛋白表达量占总分泌蛋白量的63.7%。抑菌试验结果表明,表达的防御素对大肠埃希氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌有一定的抑菌活性。

黄粉虫纤溶活性基因的克隆及在毕赤酵母中的表达及活性检测

采用PCR技术,以含有TFP(Tenebrio Fibrinolyric Proteins,TFP)c DNA质粒作为模板,扩增出TFP基因片段.将克隆获得的目的基因插入到毕赤酵母表达载体p PIC9K中,经测序无误后,获得重组表达质粒p PIC9K-TFP.将重组表达质粒线性化后电击转化到毕赤酵母GS115中,经筛选并PCR验证获得多拷贝整合型酵母工程菌,对工程菌进行发酵和甲醇诱导表达.阳性样品经纤溶平板实验验证,表明该表达蛋白具有生物活性.