pPICZα-synBPI_(m600)酵母表达载体的构建和鉴定

为使rBPIm2 3 重组抗菌蛋白在毕赤酵母表达系统中分泌表达 ,拟构建synBPIm60 0 酵母表达载体。以pUC18 synBPI41 4 质粒为模板扩增synBPI2 0 0 基因片段 ,经XhoI/EcoRI双酶切获得synBPI1 85bp基因片段 ;EcoRI/SalI双酶切PBV2 2 0 BPIm60 0 质粒获得BPIm42 0 基因片段 ;将上述 2个基因片段连接后定向克隆到pPICZα酵母表达载体上。连接产物转化E .coliTOP 10F′ ,在含Zeocin的低盐LB固体培养基上筛选阳性转化子。阳性克隆菌经菌落PCR法鉴定、酶切分析和测序鉴定 ,结果与预期相符。提示 :成功构建了pPICZα synBPIm60 0

结合利用pGAPZαA和pPICZαA构建目的蛋白的多拷贝载体并在毕赤酵母中表达

结合利用载体pGAPZαA和pPICZαA构建目的蛋白的可线性化多拷贝表达载体,并转化毕赤酵母表达目的蛋白.首先将目的蛋白基因构建到组成型表达载体pGAPZαA中,然后依据载体自身特性,用同尾酶BglⅡ和Bam HⅠ切取其表达盒并连接到甲醇诱导型载体pPICZαA中的Bam HⅠ位点处,经多次重复后获得目的蛋白多拷贝表达载体,线性化后电转化毕赤酵母表达目的蛋白.灵芝免疫调节蛋白LZ8是一个已成功在毕赤酵母中表达的蛋白,作为检验该方法的样本其基因被首先构建到载体pGAPZαA中得到质粒pGAPZαA-LZ8,切取其表达盒构建到载体pPICZαA中,经过4次重复得到了多拷贝表达载体pPICZαA-[GAPZαA-LZ8]4,然后利用pPICZαA特有的限制性内切酶位点SacⅠ进行线性化,最终电转化到毕赤酵母GS115中进行组成型表达蛋白LZ8,其表达量达到pGAPZαA-LZ8转化菌株表达量的2~3倍.经检验,结合利用载体pGAPZαA和pPICZαA可以构建目的蛋白的多拷贝表达载体,并且可以对载体进行线性化而不影响转化酵母时的转化效率.

β_2肾上腺素受体基因在毕赤酵母中的表达及活性测定

为提高β2-肾上腺素受体(β2AR)表达量,满足生产需求,使其应用到抗体技术上,利用分子克隆技术将β2-肾上腺素受体基因(β2AR)与绿色荧光蛋白基因(eGFP)克隆到毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体中。表达载体pPICZαDNAsGFP转化至酵母后,β2AR和eGFP基因与酵母基因重组。利用筛选出的阳性重组子诱导表达β2AR和eGFP的融合蛋白,通过125I标记的配体结合实验证明获得了有受体活性的融合蛋白。

抗菌肽Spinigerin基因真核表达载体的构建

采用毕赤酵母偏爱原则,人工设计合成抗菌肽Spinigerin基因。按正确的阅读框架定向克隆至真核表达载体pPICZαA,经PCR鉴定及序列分析,所转化的毕赤酵母GS115中含有Spinigerin插入基因的重组质粒pPICZαA-S,结果表明成功构建了抗菌肽Spinigerin基因真核表达载体pPICZαA-S。

辣根过氧化物酶基因真核表达载体的构建

从辣根侧根中提取总RNA,以OligodT(18)为引物,通过反转录获得了辣根总mRNA的cDNA。以获得的cDNA为模板,利用设计的一对特异寡核苷酸引物P1和P2进行PCR扩增,得到了辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP,EC1.11.1.7)同功酶C2的结构基因(hrpC2)。将hrpC2与真核表达质粒载体pPICZα-A分别用限制性内切酶EcoRI和Xbal双酶切后连接,构建了重组质粒表达载体pPICZα-A-hrpC2。将pPICZα-A-hrpC2转化大肠杆菌筛选阳性克隆并测序。测序结果显示,pPICZα-A-hrpC2重组质粒构建成功。利用BlastN程序进行DNA序列分析,显示该序列为目的ORF框,无移码突变;与Fujiyama.K,Takemura.H等报道的hrpC2序列[D90115.1]有95%的同源性。

重组人卵ZP3肽段在毕赤酵母中的表达

目的：用毕赤酵母（Pichia pastoris）表达人透明带hZP3片段,研究其抗生育作用。方法：设计特定引物从hZP3全长序列中PCR扩增794-1282nt基因片段,将扩增片段克隆到酵母表达载体pPICZα上,构建成重组质粒pPICZα-hZP3CT,线性化后的重组质粒导入毕赤酵母中,筛选出高拷贝菌株,甲醇诱导目的蛋白表达。用SDS-PAGE和Western blotting分析表达产物。结果：成功构建酵母表达载体,并在酵母菌株X-33中诱导表达重组蛋白。重组蛋白可以与鼠抗重组人卵透明带hZP3融合肽段的抗血清发生特异结合,表明目的基因成功表达。结论：重组hZP3蛋白已在酵母中成功表达,目的蛋白能与相应的抗体结合。

玫瑰微球菌中treZ基因在毕赤酵母中的表达研究

首次将玫瑰微球菌中麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)treZ基因序列连接到表达载体pPICZαA中,通过电转化法将构建好的表达载体分别转入巴斯德毕赤酵母GS115和KM71菌株中。利用含有Zeocin的YPD平板筛选到阳性转化子,并经PCR、SDS-PAGE电泳以及Western blot最终验证海藻糖水解酶基因treZ已经整合到巴斯德毕赤酵母的基因组上,并且得到了预期的表达。

响应面法优化毕赤酵母基因工程菌表达木聚糖酶条件研究

木聚糖酶作为降解木聚糖的关键酶之一,在制药、纸浆造纸和食品等领域有着广泛的应用。为了进一步提高重组毕赤酵母基因工程菌pPICZαA-QxynB(GS115)表达产木聚糖酶的能力,采用响应面法对其发酵条件进行优化。先通过Plackett-Burman法筛选出3个对产酶有显著影响的重要因素,分别为初始pH、组氨酸添加量和甲醇添加量;再利用单因素法逼近最大响应区域,并结合Box-Behnken试验获得最优的发酵条件为初始pH 58、组氨酸添加量06%、甲醇添加量085%。在最优的发酵条件下,重组菌pPICZαA-QxynB(GS115)表达木聚糖酶酶活达到3 604 U/mL,较未优化前提高了256倍,其3组平行试验值与模型的预测值基本相符,说明预测模型的可信度高,研究结果能为建立重组菌pPICZαA-QxynB(GS115)表达木聚糖酶的制备工艺提供依据。

改造后的抗菌肽AD基因在毕赤酵母中表达效价研究

通过PCR方法使抗菌肽AD基因中带有XhoⅠ和XbaⅠ酶切位点序列 ,再克隆到表达载体pPICZα A中 ,重组表达载体转化GS1 1 5 ,经重组酵母菌表达的抗菌肽AD ,其N端去除了其它氨基酸。对重组抗菌肽培养条件进行优化 ,在YEPD中含葡萄糖 2 % ,pH为 7 5 ,重组酵母菌培养 30h后 ,0 5 %甲醇诱导 42h ,杀菌效价达 1 843,是改造前的 3 1倍。最后重组抗菌肽经CM cellulose2 3柱层析得到纯化。

花鳗鲡重组促黄体生成素在毕赤酵母中的表达

采用聚合酶链反应从花鳗鲡垂体cDNA中分别扩增出GTHα、LHβ基因,再利用搭桥技术,中间以lin-ker将两个基因连接成单个基因LHβα。然后利用双酶切、连接,将LHβα基因连接到载体pPICZαA中,构建出促黄体生成素的酵母共表达载体pPICZαA-LHβα。再利用电转化法将其转入到酵母野生型菌株X-33中,在含不同浓度的zeocinYPDS平板上筛选高拷贝转化子,阳性克隆经φ=0.7%甲醇诱导表达,表达产物采用SDS-PAGE和western blot进行分析,得到所表达的产物相对分子质量约为45 000。

植酸酶基因的定点突变及其在巴斯德毕赤酵母表面展示

为解决植酸酶在制粒过程中易变性失活的问题,以黑曲霉(Aspergillus niger)ZJUY中的植酸酶基因phy A为亲本,借助聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)介导的定点突变,对植酸酶基因的关键位点进行密码子优化、引入氢键以及二硫键Cys196-Cys446的缺失突变;凭借无缝克隆成功将锚定片段FS和携带标签Flag的目的片段phy A插入酵母表达载体pPICZαC中;采用氯化锂转化法,将构建的8个表达载体pPICZαC-FS/phy A通过同源重组的方式整合到巴斯德毕赤酵母(Komagataella phaffii)GS115基因组上。细胞免疫荧光染色和流式细胞仪检测证实,基因改良后的植酸酶在巴斯德毕赤酵母细胞表面成功展示。重组菌株A31、A61和A84的植酸酶活性均可达7 000 U/g。与分泌型植酸酶相比,展示酶具有更好的高温和酸碱耐受性,其中菌株A61在90℃水浴处理1h后仍有18%的酶活,在pH 1.6~4.0范围内,残余酶活保持在80%以上。菌株A61这一特性可以克服制粒过程中(60~90℃)植酸酶变性失活的不足,能够较好地满足动物饲料用酶的需求。

一种增加重组毕赤酵母拷贝数提高胰岛素前体产量的策略

【目的】为了进一步提高毕赤酵母表达生产人胰岛素前体的产量,【方法】将构建的表达载体pPICZα-IP电转至毕赤酵母X-33中,在100μg/mL zeocin的YPDS抗性平板筛选获得过量表达人源胰岛素前体(IP)的重组菌株B4和S6。在此基础上,以过量表达胰岛素前体的B4和S6为出发菌株,以SacI线性化的表达载体pPICZα-IP进行重复电转化,并在1000μg/mL zeocin的YPDS平板上筛选获得一株拷贝数为7的重组毕赤酵母2B4。【结果】该菌株在5 L规模发酵罐上,人源胰岛素前体产量是低拷贝数菌株B7的2.7倍,且菌体并未因拷贝数高而表现出生长不良的现象。实时定量PCR检测后,发现2B4菌株胰岛素前体基因的转录水平是B7的2倍。【结论】综上结果表明,采用抗性筛选和重复电转相结合的高拷贝重组毕赤酵母构建策略,能有效促进目的基因的转录水平,最终显著提高目标蛋白的产量。

抗菌肽Spinigerin α基因定点突变体的构建

通过对Spinigerin α抗菌肽的结构分析,结合抗菌肽的抗菌机理,根据毕赤酵母的偏爱密码子对该抗菌肽进行定点突变。将亲水性氮端的碱性赖氨酸分别突变为碱性更强的精氨酸、酸性的天冬氨酸以及中性的丙氨酸,将疏水性碳端的中性亮氨酸突变成碱性的精氨酸、酸性的天冬氨酸。将定点突变后的Spinigerin α基因按正确阅读框克隆至穿梭质粒pPICZ α-A上,经PCR鉴定、序列分析,所转化的宿主酵母GS115中含有该突变体,结果表明已成功构建了抗菌肽Spinigerin α基因的突变体,为获得高效的抗菌效果的抗菌肽奠定一定的基础。

抗菌肽Cryptonin基因真核表达载体的构建

根据Cryptonin氨基酸序列,选用毕赤酵母偏爱密码子,人工设计并合成了抗菌肽Cryp-tonin基因。按正确的阅读框架定向克隆至真核表达载体pPICZαA上,经PCR、双酶切验证及序列分析,所转化的DH5α中含有插入Cryptonin基因的重组质粒pPICZαA-Cry,结果表明:成功构建了抗菌肽Cryptonin基因真核表达载体pPICZαA-Cry。

大蒜鳞茎蒜氨酸酶基因克隆及其在毕赤酵母中的表达

目的从大蒜鳞茎中克隆蒜氨酸酶基因,构建蒜氨酸酶真核表达载体,并在毕赤酵母系统中表达,进一步探讨重组蒜氨酸酶的生物学活性。方法利用RT-PCR方法克隆大蒜鳞茎蒜氨酸酶基因,通过pPIczαC载体构建pPIczαC-蒜氨酸酶真核表达质粒,电转化法导入毕赤酵母X-33,筛选阳性克隆,经甲醇诱导后取表达上清进行SDS-PAGE和Western blotting分析。利用丙酮酸法检测重组蒜氨酸酶和提取的天然蒜氨酸酶的活性,Lowry法测2种蒜氨酸酶蛋白质量,通过比活力比较2种酶活性大小。结果从大蒜内克隆出蒜氨酸酶基因,大小为1 500 bp,重组蒜氨酸酶相对分子质量约为5.5×104,存在于毕赤酵母表达上清液中。重组蒜氨酸酶比活力为(82.09±3.89)U/mg,天然蒜氨酸酶比活力为(176.49±5.06)U/mg。结论蒜氨酸酶基因可以在毕赤酵母表达系统中获得表达,重组蒜氨酸酶具有酶活性,但是其活性低于提取的天然蒜氨酸酶。

鸡IL-5基因在毕赤酵母中的表达及重组蛋白抗体间接ELISA检测方法的建立

参照GenBank中登录的鸡白介素5(IL-5)基因的核苷酸序列,设计1对特异性引物。用聚合酶链反应(PCR)以克隆载体pMD18-T-IL-5为模板扩增IL-5基因,然后将IL-5基因克隆到酵母表达载体pPICZαA中并电转化入酵母X-33,在Zeocin作为筛选标记的YPD培养基上筛选阳性菌落。经甲醇诱导表达鸡IL-5蛋白,对表达产物进行SDS-PAGE和Western-bolt分析。以纯化的鸡白介素5蛋白作为包被抗原,建立了检测鸡白介素5蛋白抗体的间接ELISA。结果显示,鸡白介素5基因获得成功表达,诱导表达培养物上清中表达出具有反应活性的26ku左右的重组鸡白介素5蛋白。从而实现了鸡白介素5蛋白高效的酵母表达。确定了间接ELISA的最佳反应条件:抗原包被浓度为10.00μg/mL,包被时间为37℃2h,血清稀释度为1∶1 600,HRP标记的山羊抗小鼠IgG抗体的稀释度为1∶1 000,血清与抗原在37℃反应1h,血清和二抗于37℃反应1h。应用该方法对试验小鼠血清进行检测,结果显示建立的ELISA具有较好的重复性,适用于检测抗鸡白介素5蛋白的抗体。

嗜酸乳杆菌亚油酸异构酶在毕赤酵母中的分泌表达

以嗜酸乳杆菌AS1.1854来源的亚油酸异构酶基因为模板,用PCR方法扩增目的片段,并克隆到pMD19T载体.经双限制性酶切的pMD19T-LAI和载体pPICZαA连接转化得到重组质粒pPICZαA-LAI.将阳性重组质粒用sacⅠ进行线性化后,经化学法转化毕赤酵母GS115.提取重组酵母GS115/pPICZαA-LAI基因组,利用交叉引物通过PCR方法筛选重组子.阳性毕赤酵母GS115/pPICZαA-LAI经1%甲醇诱导,分泌表达出相对分子质量为69 000亚油酸异构酶.经测定发酵上清酶活力为0.107 U,未破碎重组酵母酶活力0.08 U.