重组人Tum-5融合蛋白的克隆、表达、纯化及鉴定

目的:构建人肿瘤抑素(tumstatin)活性片段Tum5的融合重组表达载体并对其进行诱导表达和蛋白纯化以获得大量重组融合蛋白.方法:人工合成Tum5基因,进行测序分析,将该基因克隆入原核表达载体pQE30中,转化感受态细胞DH5α,经IPTG诱导表达重组融合蛋白,对表达产物进行TricineSDSPAGE电泳分析和WesternBlot检测分析.结果构建了重组融合表达质粒pQE30Tum5,表达的蛋白经TricineSDSPAGE电泳分析,在约Mr10×103处出现了一条新生的蛋白条带,经灰度扫描检测,表达量约占菌体总蛋白的40%,纯化后的蛋白灰度扫描检测,纯度为95%.结论:成功地构建了人Tum5基因的原核表达载体,并纯化了该基因的原核表达产物.

重组人PD-1IgV融合蛋白的克隆、表达、纯化及生物学活性检测

目的:获得具有生物学活性的重组人PD-1IgV(rh-PD-1IgV)蛋白.方法:人工合成PD-1IgV基因,并将该基因克隆入原核表达载体pQE-30中.转化宿主细胞大肠杆菌DH5α,经IPTG诱导表达重组融合rhPD-1IgV蛋白.对表达产物进行SDS-PAGE电泳和Westernblot检测分析.结果:rhPD-1IgV的Mr约为15×103,与根据其氨基酸组成计算的理论值一致.成功纯化了rhPD-1IgV蛋白,并对其进行了复性和浓缩,且复性后的蛋白可与其配体B7-H1结合,显示出良好的结合活性.结论:成功地克隆、表达和纯化了rhPD-1IgV蛋白.

口蹄疫病毒P1+2A基因在BHK–21细胞中的表达

本研究将已构建好的、包含口蹄疫病毒P1+2A基因的重组表达质粒pQE-Tri/P1+2A经质脂体2000转染哺乳动物细胞BHK-21,转染后一定时间进行检测。通过SDS-PAGE、Western-blotting、荧光抗体染色、ELISA等检测方法表明,FMDVP1+2A基因片段在BHK-21细胞中成功表达,表达的蛋白能被口蹄疫阳性血清所识别而且具有良好的生物学活性。这一结果的取得,为进一步研制新型口蹄疫基因工疫苗及其配套诊断试剂奠定了基础。

人pcDNA3.1-TPX2真核表达载体的构建与表达

目的:构建TPX2的真核表达载体pcDNA3.1-TPX2,并观察其在食管癌EC9706细胞中的表达。方法:在pQE-70-TPX2原核表达载体基础上,根据GenBank上提供的TPX2基因序列及测序结果,采用Primer Premier 5.0软件设计扩增TPX2基因编码区的引物序列,经HindⅢ和BamHⅠ双酶切,与真核表达载体pcDNA3.1连接后转化感受态大肠杆菌JM109,并进行酶切分析和序列测定。将构建的质粒pcDNA3.1-TPX2体外转染EC9706细胞,进行稳定筛选。用Western blot鉴定基因的表达。结果:DNA测序和BLAST比对表明克隆的人TPX2基因序列正确,进一步酶切分析显示,成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-TPX2,并在EC9706细胞中获得稳定表达。结论:TPX2基因真核表达载体的成功构建为后续研究TPX2基因在肿瘤细胞中的功能奠定了基础。

小鼠巨噬细胞Ipr1基因真核表达载体的构建及表达

目的构建小鼠Ipr1(intracellular pathogen resistance 1)基因真核表达载体。方法从C57BL/6J小鼠胸腺组织提取总RNA,以RT-PCR法调取Ipr1基因编码序列,克隆至pMD19-Tsimple载体中,转化大肠杆菌JM109,筛选的阳性克隆作PCR及酶切鉴定后测序分析。其中的突变碱基经点突变修复后将Ipr1基因亚克隆于原核真核双系统表达质粒pQE-TriSystem中得到pQE-TriSystem-Ipr1,用脂质体瞬时转染小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞,RT-PCR鉴定Ipr1基因的表达。结果从C57BL/6J小鼠胸腺组织内扩增出大小为1338bp片段。阳性克隆测序鉴定发现一个点突变,经点突变修复后与GenBank报道的Ipr1基因序列一致。亚克隆获得重组质粒pQE-TriSystem-Ipr1,转染RAW264.7细胞经RT-PCR扩增出Ipr1基因相应大小的DNA片段。结论成功调取小鼠Ipr1基因并成功构建含Ipr1基因的真核表达载体,为进一步研究Ipr1基因的功能奠定基础。