不同频率电针介导PINK1/Parkin通路治疗STC模型大鼠的机制研究

目的 探讨不同频率电针介导线粒体自噬相关蛋白(PINK1)/帕金蛋白(Parkin)通路治疗慢传输型便秘(STC)模型大鼠的作用。方法 取34只8周龄雄性健康SD大鼠,采用随机数字表分为正常对照组7只和建模组27只。建模组采用洛哌丁胺混悬液灌胃法制备STC模型大鼠,建模成功后采用随机数字表分为模型对照组,2 Hz、50 Hz电针组和假电针组。2 Hz、50 Hz电针组予以电子针疗仪频率2 Hz、50 Hz,强度10 mA刺激“后三里”,假电针组针刺“后三里”但不通电,模型对照组和正常对照组仅固定处理,每天30 min,每天1次,持续14 d。碳素墨汁灌胃法检测肠道推进率;苏木素-伊红(HE)染色观察结肠组织病理改变;免疫荧光共聚焦显微镜观察结肠Cajal间质细胞(ICC)形态;免疫组化及蛋白质免疫印迹(WB)法检测结肠组织原癌基因(C-Kit)、PINK1、Parkin、自噬效应蛋白1(Beclin1)、核孔糖蛋白(p62)、自噬相关蛋白3(LC3)蛋白表达。结果 与模型对照组、假电针组比较,50 Hz电针组、2 Hz电针组增加肠道推进率[(60.63±10.21)%、(55.84±9.04)%比(48.43±7.02)%、(49.60±8.19)%,P<0.05]、ICC数量[(29.78±4.19)个、(20.45±4.37)个比(10.50±2.11)个、(11.02±2.28)个,P<0.05]、免疫荧光积分光密度(IOD)值[(2101.35±320.33)、(1936.04±307.26)比(1615.82±276.33)、(1635.97±281.52),P<0.05]、C-kit蛋白表达[(1.26±0.21)、(0.92±0.17)比(0.45±0.07)、(0.48±0.09),P<0.05]、p62蛋白表达[(1.06±0.19)、(0.87±0.13)比(0.54±0.09)、(0.55±0.10),P<0.05]。与模型对照组、假电针组比较,50 Hz电针组、2 Hz电针组降低PINK1蛋白表达[(0.37±0.08)、(0.59±0.11)比(0.85±0.17)、(0.83±0.15),P<0.05]、Parkin蛋白表达[(0.55±0.09)、(0.78±0.12)比(1.02±0.21)、(1.04±0.22),P<0.05]、Beclin1蛋白表达[(0.61±0.11)、(0.90±0.13)比(1.07±0.21)、(1.09±0.23),P<0.05]、LC3蛋白表达[(0.69±0.12)、(0.82±0.15)比(1.14±0.18)、(1.11±0.20),P<0.05]。正常对照组大鼠结肠组织、ICC形态均正常,模型对照组和假电针组均呈显著改变,2 Hz电针组和50 Hz电针组均改善,且50 Hz电针组基本接近正常对照组。结论 电针“后三里”能够减轻STC大鼠结肠模型病理改变和ICC形态学改变,且可能可下调PINK1、Parkin、Beclin1、LC3表达,上调Ckit、p62表达,其中50 Hz电针作用更佳。

艾帕素13(apelin-13)通过阻断PINK1/parkin信号通路促进线粒体自噬改善大鼠心肌缺血再灌注损伤

目的研究脂肪细胞因子艾帕素13(AP13)对心肌缺血再灌注损伤(MIRI)中线粒体自噬水平的影响及机制。方法通过结扎大鼠冠状动脉分支建立MIRI模型,大鼠分为假手术组、AP13处理的假手术组、MIRI组、AP13处理的MIRI组。MIRI模型建立24 h后,采用ELISA检测血清肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、心肌肌钙蛋白I(cTnI)水平,2,3,4-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色检测大鼠心肌梗死面积,原位末端转移酶标记技术(TUNEL)检测MIRI心肌区的心肌细胞凋亡水平,透射电镜观察受损心肌区心肌细胞线粒体损伤情况及自噬体的形成。取各组大鼠心肌梗死区组织,Western blot法检测细胞中微管相关蛋白1轻链3Ⅱ(LC3Ⅱ)/LC3Ⅰ比值,泛素结合蛋白P62蛋白及线粒体自噬通路中磷酸酶与张力蛋白同源物诱导激酶1(PINK1)、泛素连接酶parkin和裂解型胱天蛋白酶3(c-caspase-3)的蛋白表达。采用携带GFP-LC3的腺病毒感染分离的各组大鼠心梗区心肌细胞,并采用免疫荧光细胞化学染色观察线粒体外膜转位酶20(TOM20)和LC3的共定位。结果与假手术组或AP13处理的假手术组相比,MIRI组或AP13处理的MIRI组大鼠血清CK、LDH、cTnI和心肌梗死面积和细胞凋亡率均显著增加,前两组无明显差异。而与MIRI组相比,AP13处理的MIRI大鼠的上述变化均明显降低。与假手术组或AP13处理的假手术组相比,MIRI组或AP13处理的MIRI组大鼠心肌细胞中线粒体结构的完整性明显破坏,且包裹线粒体的自噬体大量出现,而与MIRI组相比,AP13处理的MIRI组大鼠的心肌细胞线粒体损伤明显减轻,自噬体的数量显著增加。MIRI组或AP13处理的MIRI组梗死心肌组织中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值、PINK1、parkin及c-caspase-3蛋白表达均显著增加,P62表达水平明显降低,而与MIRI组相比,AP13处理的MIRI组中上述蛋白水平的变化趋势明显降低;MIRI造模后LC3与TOM20共定位于心肌细胞线粒体中,且在AP13处理的MIRI组中LC3的表达强度较MIRI组显著增加。结论AP13可能通过阻断PINK1/parkin信号通路,促进线粒体自噬水平减少MIRI造成的心肌梗死面积,降低细胞凋亡率。

Parkin与α-酮戊二酸载体蛋白(OGCP)的相互作用研究

Parkin基因是帕金森病的致病基因之一,Parkin蛋白作为泛素-蛋白酶体通路(ubiquitin-proteasome pathway,UPP)的一种E3酶,介导了多种底物的泛素化过程,而后者与帕金森病的发病机制有着密切的联系.α-酮戊二酸载体蛋白(2-oxoglutarate carrier protein,OGCP)是一种线粒体内膜蛋白.采用激光共聚焦技术和免疫共沉淀技术证实,在HEK293细胞中Parkin蛋白与OGCP共定位,且二者之间存在相互作用关系;通过体内、外泛素化实验发现Parkin蛋白能介导OGCP的泛素化.提示OGCP可能是Parkin蛋白的泛素化底物蛋白,且Parkin蛋白能促进OGCP的泛素化.

VEGF、EGFR及Parkin蛋白在鼻咽癌中的表达及三者间的相关性研究

目的探讨血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子受体(EGFR)及Parkin蛋白在鼻咽癌(NPC)中的表达情况以及三者间的相关性。方法应用免疫组化SP法检测48例NPC组织和34例正常鼻咽部上皮组织中VEGF、EGFR及Parkin蛋白的表达,并探讨三者间的相关性。结果 NPC组织中VEGF和EGFR蛋白表达阳性率明显高于正常鼻咽部上皮组织,Parkin蛋白表达阳性率则明显下降,且均有统计学差异(均P<0.05)。NPC组织中VEGF蛋白表达与NPC患者有无淋巴结转移及临床TNM分期密切相关(均P<0.05),而与患者的年龄、性别、病理类型、T分期均无关(均P>0.05);EGFR和Parkin蛋白表达与NPC患者有无淋巴结转移密切相关(均P<0.05),而与患者的年龄、性别、病理类型、T分期、临床TNM分期均无关(均P>0.05)。NPC组织中VEGF和EGFR蛋白的表达呈正相关(P<0.05),Parkin和VEGF、EGFR蛋白的表达无相关性(均P>0.05)。结论 VEGF、EGFR及Parkin蛋白与NPC发生、发展有关,VEGF、EGFR及Parkin蛋白表达可作为NPC的预后判断指标,NPC中VEGF和EGFR可能起协同作用,而Parkin则可能单独发挥作用。

2型糖尿病病人外周血同源性磷酸酶-张力蛋白诱导的激酶1、Parkin蛋白、视神经蛋白表达与肾损伤程度的关系研究

目的探究2型糖尿病(T2DM)病人外周血同源性磷酸酶-张力蛋白诱导的激酶1(PINK1)、Parkin蛋白、视神经蛋白(OPTN)表达及与肾损伤程度关系。方法选取2019年5月至2021年5月河南科技大学第一附属医院156例T2DM病人,根据糖尿病肾病(DN)诊断分期标准,分为非DN组92例、早期DN组(EDN组)38例、临床期DN组(CDN组)26例,另以同期60例健康体检者为健康组。比较四组病人外周血PINK1、Parkin蛋白、OPTN表达量(荧光定量PCR法);采用Pearson相关分析法探究PINK1、Parkin蛋白、OPTN表达量与糖脂代谢空腹血糖、糖化血红蛋白(HbA1c)、总胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)及肾功能指标血尿素氮、血肌酐、预估肾小球滤过率(eGFR)、尿微量白蛋白/尿肌酐(UACR)、24 h尿蛋白排泄率(UAER)相关性,采用多因素logistic回归分析探究DN发生影响因素,绘制ROC曲线分析PINK1、Parkin蛋白、OPTN表达量对DN诊断价值。结果CDN组、EDN组、非DN组、健康组外周血PINK1 mRNA表达量分别为0.31±0.17、0.44±0.20、0.69±0.35、0.73±0.34,Parkin蛋白mRNA分别为0.51±0.12、0.62±0.18、0.79±0.28、0.98±0.35,OPTNmRNA分别为0.05±0.01、0.10±0.03、0.14±0.05、0.18±0.07,四组病人外周血PINK1、Parkin蛋白、OPTN表达量差异有统计学意义(P<0.05),均表现为CDN组<EDN组<非DN组<健康组。T2DM病人外周血PINK1、Parkin蛋白表达量均与空腹血糖、HbA1c、血尿素氮、血肌酐、UACR、UAER呈负相关(P<0.05),与eGFR呈正相关(P<0.05);OPTN与血尿素氮、血肌酐、UACR、UAER呈负相关(P<0.05),与eGFR呈正相关(P<0.05)。糖尿病病程、HbA1c、UACR、UAER是DN的独立危险因素(P<0.05),PINK1、Parkin蛋白、OPTN为其保护因素(P<0.05)。外周血PINK1、Parkin蛋白、OPTN表达量诊断DN的ROC曲线下面积分别为0.709、0.754、0.839。结论T2DM病人外周血PINK1、Parkin蛋白、OPTN表达量均下调,且随着病人肾损伤程度增加而降低,检测外周血PINK1、Parkin蛋白、OPTN表达量对DN有一定诊断价值。

Parkin蛋白在鼻咽癌中表达及临床意义

目的研究Parkin蛋白在鼻咽癌中表达及临床意义。方法运用Elivision TM S-P免疫组化技术的方法检测54例鼻咽癌组织和16例正常鼻咽上皮组织Parkin蛋白表达水平,分析Parkin蛋白表达与鼻咽癌患者临床病理特征关系。结果54例鼻咽癌组织Parkin蛋白表达水平为"-"23例,"+"12例,"++"7例,"+++"12例,16例正常鼻咽上皮组织Parkin蛋白表达水平为"-"0例,"+"0例,"++"3例,"+++"13例,鼻咽癌组织Parkin蛋白表达明显降低(P<0.05),Parkin蛋白表达与患者年龄、性别、T分期、TNM分期、病理类型无明显关系(P>0.05),而与淋巴结转移有关(P<0.05)。结论 Parkin基因在鼻咽癌的发生发展中起抑癌基因作用,Parkin蛋白表达可作为判断鼻咽癌临床预后预测指标。

Parkin,Parkin底物和帕金森病

Parkin是隐性遗传性少年型帕金森病的致病基因.现认为Parkin行使泛素蛋白连接酶功能,参与蛋白质的泛素化过程.它的功能缺陷致使其底物蛋白质毒性积聚,从而介导多巴胺能神经元选择性死亡.越来越多的研究显示Parkin还具有神经保护作用,能对抗多种神经毒性刺激,并且可能参与路易体的形成过程,因此认为它在散发性帕金森病的致病过程中也可能起重要作用.

β-细辛醚激活PINK1/Parkin介导的线粒体自噬改善APP/PS1小鼠认知和记忆功能障碍的研究

目的探讨β-细辛醚对淀粉样前体蛋白(APP)/早老素1(PS1)小鼠的作用机制及对PINK1/Parkin介导的线粒体自噬的影响。方法将APP/PS1小鼠随机分为模型组、β-细辛醚低、中、高剂量组(15、30、45 mg/kg)、多奈哌齐组(1 mg/kg)、雷帕霉素组(4 mg/kg)、3-甲基腺嘌呤(3-MA)组(4 mg/kg)、环孢霉素A组(10 mg/kg),另设正常组,每组10只。各组灌胃给药,模型组和正常组用等体积蒸馏水代替,1次/d,给药30 d。观察各组小鼠水迷宫实验,蛋白质印迹法检测小鼠海马中APP、PS1、神经突触素1(SYN1)、β-位点淀粉样前体蛋白裂解酶1(BACE1)、LC3 I/II、Beclin-1、p62、PINK1、Parkin和p-Parkin蛋白表达水平;反转录聚合酶链反应检测APP、PS1、BACE1、LC3B、Beclin-1、p62和Parkin mRNA表达水平。结果与模型组相比,β-细辛醚高剂量组、β-细辛醚中剂量组和多奈哌齐组APP/PS1小鼠的逃避潜伏期缩短(P<0.05或P<0.01),小鼠海马内APP、PS1、BACE1的表达下降(P<0.01),SYN1表达上升(P<0.05或P<0.01);与模型组相比,β-细辛醚中剂量组APP/PS1小鼠内Beclin-1、LC3B表达均升高(P<0.05或P<0.01),p62表达下降(P<0.05);与模型组相比,雷帕霉素组Beclin-1、LC3B表达均升高(P<0.05或P<0.01),p62表达下降(P<0.01);与模型组相比,3-MA组p62表达升高(P<0.05);与模型组相比,β-细辛醚中剂量组APP/PS1小鼠内PINK1、p-Parkin表达均显著升高(P<0.01)。结论β-细辛醚通过激活PINK1-Parkin介导的线粒体自噬而影响阿尔茨海默病病理,这为应用β-细辛醚治疗阿尔茨海默病提供了新的靶点。

肝细胞癌中Lumican和Parkin的表达及意义

目的探讨肝细胞癌组织中Lumican蛋白及Parkin蛋白的表达及意义,并分析两者的相关性。方法应用免疫组织化学S-P法检测62例肝癌患者癌组织及62例癌旁组织中Lumican及Parkin蛋白的表达并分析其与临床病理因素之间的关系。结果 (1)肝癌组织中Lumican、Parkin的阳性表达率分别为35.5%、32.3%,与癌旁组织的阳性表达率比较(66.1%、72.6%),差异具有统计学意义(P<0.05);(2)Lumican蛋白的表达与Edmondson分级及是否伴有门静脉癌栓相关(P<0.05),而与性别、肿瘤大小、HBsAg、肝硬化和AFP无关(P>0.05);(3)Parkin蛋白的表达与患者肝癌Edmondson分级、AFP水平、是否伴有门静脉癌栓相关(P<0.05),而与性别、肿瘤大小、HBsAg和肝硬化无关(P>0.05);(4)Lumican与Parkin呈正相关(r=0.450;P<0.05)。结论 Lumican与Parkin蛋白在肝细胞癌组织中表达率均较低,可能与肝癌的发生、发展有关,联合检测两者对肝癌的诊断和预后有着重要意义,有望成为肝癌治疗的新靶点。

Parkin蛋白C端的表达及抗体的制备

目的 :构建Parkin基因 3’端的表达质粒 ,在大肠杆菌中表达并制备多克隆抗体。方法 :构建Parkin基因3’端 (937～ 195 9bp)的谷氨酰胺硫转移酶 (glutathion sulfate transferase ,GST)融合表达质粒 ,在JM 10 5中获得表达。用Triton 10 0 (1% )和Tween 2 0 (1% )处理 ,并用亲和层析纯化表达产物 ,将其免疫新西兰兔 ,用免疫印迹分析收获的兔抗血清。结果 :构建的ParkinC表达质粒在JM 10 5中获得表达 ,以分子量为 4 2kD的包涵体存在 ;目的蛋白纯度为 95 % ;得到效价为 1∶6 4的抗血清 ;免疫印迹分析表明 ,制备的抗血清可与鼠脑细胞抽提物中 5 1 6kD的蛋白产生特异的免疫反应。结论 :Parkin蛋白C端在 JM 10 5

稳定表达GFP-Parkin融合蛋白的SH-SY5Y细胞系的建立和功能初探

目的:建立稳定表达GFP-Parkin的SH-SY5Y细胞系,并检测Parkin对MPP^+引起的SH-SY5Y细胞损伤的保护作用。方法:将Parkin编码序列克隆到载体pEGFP-C1中,构建重组质粒pEGFP-Parkin,转染SH-SY5Y细胞,通过G418筛选,建立稳定表达GFP-Parkin的SH-SY5Y细胞系;荧光显微镜和Western印迹鉴定Parkin表达,MTT法检测Parkin对MPP^+致细胞损伤的保护作用。结果:酶切鉴定及测序结果表明重组质粒pEGFP-Parkin构建正确;荧光显微镜下可见细胞内有GFP-Parkin的融合表达,Western印迹检测发现相对分子质量79×103的蛋白条带;MTT结果显示Parkin能够减弱MPP^+对SH-SY5Y细胞的损伤,与对照组相比,存活率高约15%,差异显著(P<0.05)。结论:构建了稳定表达GFP-Parkin的SH-SY5Y细胞系,为进一步研究Parkin的细胞保护作用和其他功能机制奠定了基础。

Parkin蛋白与帕金森病

分子遗传学研究证明 parkin基因是常染色体隐性遗传性少年型帕金森综合征 (AR JP)的致病基因 ,其表达产物parkin蛋白具有E3泛素 蛋白连接酶活性。Parkin蛋白可能在维持多巴胺能神经元的正常功能中发挥重要作用 ,而parkin蛋白功能障碍可能与帕金森病的发病有关。目前已经鉴定了几种 parkin蛋白的底物蛋白 ,使我们能够初步了解帕金森病发病的分子和细胞学机理 ,这对于我们最终搞清帕金森病的发病机制、开发相应的治疗药物具有极其重要的意义。本文综述了parkin蛋白最新研究进展。

Parkin相关疾病的研究进展

Parkin被日本学者证实与青少年型帕金森疾病相关后逐渐被越来越多的学者重视,并围绕其展开了大量研究。国内外诸多研究表明,Parkin的作用广泛,除帕金森疾病之外,其他相关疾病也依次被证实和Parkin及其与蛋白底物的相互作用相关,尤其在多种肿瘤以及白血病的发生和发展中具有重要作用。该文将就Parkin的最新研究展开综述。

Parkin蛋白对帕金森细胞模型中α-突触核蛋白表达的抑制作用及机制

目的探讨Parkin蛋白在6-羟基多巴胺(6-OHDA)诱导的帕金森细胞模型中的作用及机制,构建Parkin过表达PC12稳转细胞株。方法通过CCK8法确定6-OHDA对细胞半致死造模浓度;运用qPCR和Westernblot检测细胞株中Parkin mRNA和蛋白水平;在Parkin过表达PC12细胞株和PC12细胞中加入6-OHDA处理24 h,采用CCK8法检测各组细胞活力,流式细胞术检测线粒体的膜电位水平和细胞活性氧(ROS)水平变化,qPCR和Westernblot检测各组细胞内促凋亡基因Bax、帕金森相关基因α突触核蛋白(α-synuclein)的表达水平。结果6-OHDA的造模浓度为50μmol/L;构建Parkin过表达细胞株;相对于PC12+6-OHDA组,用50μmol/L浓度6-OHDA处理Parkin过表达PC12细胞株,线粒体膜电位水平有显著升高的趋势(P<0.05),ROS水平显著升高(P<0.05),细胞内Bax和α-synuclein的蛋白表达水平明显减少(P<0.01)。结论Parkin蛋白在6-OHDA诱导的帕金森细胞模型中具有保护作用,其机制可能与Parkin蛋白通过抑制线粒体凋亡通路和降低α-synuclein蛋白表达相关。

复方蒲黄汤对缺血性脑损伤小鼠脑组织中Parkin、Cyclin E蛋白的影响

目的通过观察缺血性脑损伤小鼠脑组织中Parkin、细胞周期素E（Cyclin E）蛋白在用药前后的表达变化,探讨复方蒲黄汤对缺血性脑病的神经保护机制及Parkin蛋白与缺血性脑病的关系。方法 48只雄性C57小鼠随机分成对照组、模型组、药物组,每组各16只。药物组用复方蒲黄汤干预缺血性脑损伤小鼠模型,等量生理盐水灌注胃模型组和对照组小鼠。分别于损伤后0、6、12、24 h断头取脑,免疫组化检测Parkin、Cyclin E的含量。结果模型组Parkin的表达较高,12 h后达到高峰,12~24 h下降,但总体高于对照组（P〈0.05）;药物组Parkin整体表达变化类同模型组,但各亚组表达量均低于模型组（P〈0.05）,且24 h处下降趋势明显缓于模型组。模型组与药物组Cyclin E的表达都较高,其中12 h处模型组依旧上升,而药物组开始下降,模型组与对照组差异显著（P〈0.05）;模型组与药物组在0、24 h时差异有统计学意义（P〈0.05）,6、12 h时差异无统计学意义（P〉0.05）。结论复方蒲黄汤可能通过诱导Parkin过表达及抑制Cyclin E表达,达到对缺血性脑病神经元损伤的早期防护。

积雪草苷调控SIRT1-FOXO3-PINK1-Parkin通路介导的线粒体自噬保护肾缺血再灌注损伤的机制研究

目的探讨积雪草苷(AC)调控沉默信息调节因子1(SIRT1)-叉头盒转录因子O3(FOXO3)-PTEN诱导性激酶蛋白1(PINK1)-E3泛素连接酶(Parkin)通路介导线粒体自噬对肾缺血再灌注损伤(RIRI)的保护作用及机制。方法采用随机数字表法将50只雄性SD大鼠分为假手术组(Sham组)、模型组(Model组)、AC组、AC+SIRT1抑制剂(EX-527)组、EX-527组,每组10只。构建RIRI模型;AC组造模前予以AC混悬液80 mg/(kg·d)连续灌胃4周;AC+EX-527组造模前3 d予以含EX-527(5 mg/kg)的1%DMSO溶液腹腔注射,术中再灌注前20 min腹腔注射1次,余处理同AC组;EX-527组仅予以等量含EX-527的1%DMSO溶液腹腔注射。造模24 h后取材,检测血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)水平,HE染色观察肾组织病理改变及评分,Western blot检测组织SIRT1、FOXO3、PINK1、Parkin通路蛋白和自噬相关蛋白Beclin1、微管相关蛋白轻链3(LC3)A/B-Ⅰ、LC3A/B-Ⅱ表达水平,并计算(LC3A/B-Ⅱ)/(LC3A/B-Ⅰ);紫外分光光度法检测组织ATP含量;JC染色法检测线粒体膜电位变化。结果与Sham组比较,Model组Scr、BUN水平升高,肾组织发生病理损伤,通路及自噬相关蛋白表达量出现不同程度升高,ATP含量减少,线粒体膜电位水平下降(P<0.05);相比Model组,AC组Scr、BUN水平明显降低,肾组织病理损伤减轻,通路及自噬相关蛋白表达水平升高,ATP含量增高,线粒体膜电位升高(P<0.05);与AC组比较,经EX-527干预的AC+EX-527、EX-527组Scr、BUN水平出现不同程度升高,组织病理损伤加重现象,通路及自噬相关蛋白表达量均减少,ATP含量减少,线粒体膜电位水平下降(P<0.05),EX-527组程度较为明显。结论AC通过上调SIRT1-FOXO3-PINK1-Parkin信号通路蛋白表达,促进线粒体自噬来改善肾组织细胞线粒体功能,抑制细胞凋亡,对RIRI起到保护作用。

人源Parkin蛋白在大肠杆菌BL-21(DE3)中的异源表达和纯化

目的在大肠杆菌中异源表达和纯化人源Parkin蛋白。方法构建带有人源Parkin基因的克隆载体,测序保证Parkin基因序列正确后,构建异源表达载体pET-28a/Parkin;在Escherichia coli BL21(DE3)中诱导人源Parkin蛋白过表达,采用镍亲和色谱纯化人源Parkin蛋白,用Western印迹(WB)和荧光分光光度法评价人源Parkin蛋白活性。结果人源Parkin蛋白在E.coli BL21(DE3)中获高表达,经镍亲和色谱纯化后除去了大量杂蛋白,得到富集;WB和荧光分光光度法检测均证实异源表达的人源Parkin蛋白具有生物活性。结论通过异源表达技术获得高纯度的且具有生物活性的人源Parkin蛋白,可用于Parkin调节剂的快速筛选与研究。

脂多糖诱导脓毒症小鼠心肌细胞及线粒体自噬

目的探讨脓毒症心肌损伤时心肌细胞及线粒体自噬水平的变化。方法雄性C57BL/J小鼠随机分为空白对照组(NC)、LPS处理6、12、24、36 h组。LPS处理组小鼠腹腔注射10 mg/kg LPS建立脓毒症模型,空白对照组注射等量生理盐水。分别于以上时间点处死小鼠,收集血液及心脏组织,提取心肌组织胞质蛋白、线粒体及线粒体蛋白,另取心肌组织进行冰冻切片;应用ELISA试剂盒测定血清心肌肌钙蛋白I(c Tn I)含量变化;JC-1染色结合荧光酶标仪检测LPS刺激后不同时间点线粒体膜电位变化;Western blot法检测自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3)、PTEN诱导激酶1(pink1)、E3泛素连接酶帕金森病蛋白(parkin)水平;免疫荧光组织化学染色检测心肌组织LC3、pink1/parkin蛋白的定位及其在不同处理组的表达差异。结果与对照组相比,LPS诱导的脓毒症小鼠血清c Tn I在6 h即开始明显升高;LPS处理组线粒体膜电位下降,在LPS 12 h组最低;细胞自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ在腹腔注射LPS 12 h明显升高,然后逐渐下降;pink1/parkin在腹腔注射LPS 6 h明显升高,然后逐渐下降。结论脓毒症心肌损伤时心肌细胞及线粒体自噬水平升高,自噬应激可能更早发于心肌线粒体。

针刺对运动性骨骼肌损伤大鼠骨骼肌线粒体自噬的影响

目的:通过观察针刺对大负荷运动大鼠骨骼肌线粒体自噬相关蛋白表达的影响,探讨针刺在运动性骨骼肌损伤修复中的作用及其机制。方法:将128只成年雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为4组:空白对照(control,C;n=8)组、单纯运动(exercise,E;n=40)组、单纯针刺(acupuncture,A;n=40)组和运动针刺(exercise and acupuncture,EA;n=40)组。其中,E和EA组进行1次下坡跑运动,A组和EA组(运动后即刻)施加针刺处理。后3组根据干预后不同时相又分为0 h、12 h、24 h、48 h和72 h亚组(n=8),分别于对应时点分离比目鱼肌进行检测,使用透射电子显微镜观察骨骼肌线粒体超微结构变化;采用ELISA法检测比目鱼肌线粒体定量酶柠檬酸合成酶(CS)的含量变化;应用Western blot法检测骨骼肌PTEN诱导假定激酶1(PINK1)、parkin和微管相关蛋白1轻链3(LC3)的蛋白表达变化。结果:1次大负荷运动后大鼠比目鱼肌线粒体出现明显肿胀和肌膜下积聚等超微结构异常变化,伴有大量自噬体形成;同时CS的含量明显减少(P<0.05);线粒体自噬蛋白PINK1、parkin和LC3均出现一过性的表达升高(P<0.05)。运动后针刺明显改善了线粒体超微结构的异常变化,减少自噬溶酶体的出现,同时抑制CS的含量减少,下调PINK1、parkin和LC3在线粒体上的表达(P<0.05)。结论:1次大负荷运动后骨骼肌线粒体结构和数量受损,通过激活PINK1/parkin途径诱发线粒体自噬的过度发生。大负荷运动后针刺可以缓解骨骼肌线粒体的损伤,其作用机制可能是通过下调线粒体外膜蛋白PINK1表达,抑制其对下游胞浆蛋白parkin的招募,进而影响LC3与线粒体的结合以抑制线粒体自噬过度激活。

化浊解毒活血通络方对脑缺血再灌注损伤大鼠线粒体自噬相关蛋白PINK1和Parkin的影响

目的:研究化浊解毒活血通络方对脑缺血再灌注损伤大鼠的脑保护作用及对线粒体自噬相关蛋白PTEN诱导激酶1(PINK1)、Parkin的影响。方法:将48只雄性SPF级SD大鼠随机分为假手术组、模型组、中药组(化浊解毒活血通络方)、抑制剂组[3-甲基腺嘌呤(3-MA)抑制剂],每组12只。按照Longa法制备大脑中动脉栓塞(MCAO)大鼠模型,造模成功给药3 d后,行大鼠神经功能缺损评分,HE染色观察脑组织病理改变,TTC染色观察脑梗死体积,Western Blot检测脑组织PINK1、Parkin蛋白的表达,实时荧光定量PCR检测脑组织中PINK1、Parkin mRNA的表达。结果:与假手术组比较,模型组神经功能缺损评分和脑梗死体积显著增加(P<0.05),病理损伤加重,PINK1、Parkin蛋白及mRNA表达水平显著升高(P<0.05);与模型组比较,中药组大鼠神经功能缺损评分和脑梗死体积显著减少(P<0.05),病理损伤减轻,PINK1、Parkin蛋白及mRNA表达水平显著升高(P<0.05);与模型组及中药组比较,抑制剂组大鼠神经功能缺损评分和脑梗死体积显著增加(P<0.05),病理损伤加重,PINK1、Parkin蛋白及mRNA表达水平显著降低(P<0.05)。结论:化浊解毒活血通络方对脑缺血再灌注损伤大鼠具有脑保护作用,其机制可能与上调线粒体自噬相关蛋白PINK1、Parkin的表达相关。