手动膜片钳检测盐酸罗哌卡因及其右旋异构体对HEK293细胞hERG电流的影响

目的研究比较盐酸罗哌卡因和盐酸罗哌卡因右旋异构体对高表达hERG钾通道的HEK293细胞hERG电流的影响。方法用手动膜片钳检测转染后hERG钾通道稳定表达的HEK293细胞电流,多菲莱德做阳性药,将盐酸罗哌卡因和盐酸罗哌卡因右旋异构体依次稀释成30.00、10.00、3.33、1.11、0.37μmol·L^(-1),依次作用于细胞,记录电流变化,计算抑制率。结果盐酸罗哌卡因0.37、1.11、3.33、10、30μmol·L^(-1)对电流Iherg-tail的抑制率分别为(6.12±0.30)%、(13.04±1.20)%、(19.21±0.33)%、(35.56±0.66)%、(65.37±4.17)%,IC_(50)为19.482μmol·L^(-1)(n=15)。盐酸罗哌卡因右旋异构体0.37、1.11、3.33、10.00、30.00μmol·L^(-1)对电流Iherg-tail的抑制率分别为(4.13±3.43)%、(7.34±5.60)%、(9.49±2.75)%、(16.60±0.87)%、(31.36±1.45)%,IC_(50)>30μmol·L^(-1)(n=15)。阳性对照药品多菲莱德0.00185、0.00556、0.01667、0.05000、0.15000μmol·L^(-1)对电流Iherg-tail的抑制率分别为(7.81±2.77)%、(19.67±1.88)%、(57.16±4.39)%、(89.71±3.55)%、(99.66±0.89)%、IC_(50)为0.015μmol·L^(-1)(n=15)。结论和阳性对照药品多菲莱德比较,盐酸罗哌卡因对hERG通道为弱抑制作用,盐酸罗哌卡因右旋异构体对hERG通道为无明显抑制作用。

牛磺酸对豚鼠单一心室肌细胞钙离子电流的作用

应用全细胞膜片钳制技术观察了牛磷酸对豚鼠单一心室肌细胞慢内向钙离子电流(Ica)的作用。实验结果显示:牛磺酸能减少心室肌细胞的Ca^(2+)内流。此作用具有明显的电压依赖性,对其反转电位无明显影响。牛磺酸减少Ica的作用也具有剂量依赖关系,0.1μmol·L^(-1)牛磺酸减小Ica约17％,最大效应浓度接近100μmol·L^(-1)。在停止刺激休息后,首次给予刺激,10μmol·L^(-1)牛磺酸则使Ica减小47％。通过增加刺激频率,牛磺酸能促进Ica的减小。上述结果表明,牛磺酸以电压和使用依赖的方式减少心室肌细胞的钙离子内流。

白花前胡甲素对豚鼠心室肌单细胞迟发性外向钾电流的影响

用全细胞膜片钳制方法观察了中药白花前胡有效成分白花前胡甲素（Ｐｄ一Ｉａ）对豚鼠·Ｃ室肌单细胞迟发性外向钾电流（Ｉｋ）的影响。Ｐｄ一Ｉａ以剂量依赖的方式增加Ｉｋ，其阈浓度接近ｌｎｍｏｌ·Ｌ－１，ＥＣ５０约０．２μｍｏｌ·Ｌ－１，最大效应浓度约１μｍｏｌ·Ｌ－１增加Ｉｋ２．５±０．５倍（Ｐ＜０．０１），Ｐｄ一１３的此种作用通过冲洗可部分消退。从电流一电压关系可知：人的激活电压接近４０ｍＶ，ｌｐｍｏｌ·Ｌ－１ｐｄ一Ｉａ使Ｖ１／２最大左移７ｍＶ，曲线的斜率改变－０．６５ｍＶ，经比较无统计学意义，提示Ｐｄ一Ｉａ对Ｉｋ的激活动力学过程无明显影响。以上结果表明，Ｐｄ一Ｉａ能促进Ｋ＋通道开放。

大鼠海马CA_1区锥体细胞的急性分离和鉴定

目的：建立一种适用膜片钳技术的大鼠海马ＣＡ１区锥体细胞的急性分离方法，并对其进行鉴定。方法：采用酶加机械分离法制备７～１０ｄ鼠龄的大鼠海马ＣＡ１区锥体细胞，用免疫荧光技术鉴定神经元，其电生理学特性测定用全细胞膜片钳技术。结果：分离的锥体细胞是海马ＣＡ１区锥体细胞，且具有正常的电生理学特性，并保存了某些主要的电压依赖性和受体依赖性离子通道特性。结论：成功地建立了一种简单、快速、高产的适用于膜片钳技术的大鼠海马ＣＡ１区锥体细胞的急性分离方法。

1-磷酸鞘氨醇对豚鼠心室肌细胞钙电流的影响

目的 :研究 1-磷酸鞘氨醇 (S1P)对心室肌细胞膜钙离子通道的作用及机制。方法 :L angendorff离体心脏逆向灌流法分离豚鼠心室肌细胞 ,随机选取心室肌细胞分为正常对照组和 S1P0 .1、 1.0和 10 .0 μmol· L- 1 剂量组以及百日咳毒素 (PTX) 0 .1m g· L- 1 +S1P1.0 μm ol· L- 1 组。采用全细胞膜片钳技术分别记录各组心室肌细胞 Ca2 + 电流。结果 :1.0 μmol· L- 1 的 S1P使豚鼠心室肌细胞 Ca2 + 电流从给药前的 (0 .2 5 6± 0 .0 30 ) m V增加到(0 .36 7± 0 .0 90 ) m V (P<0 .0 5 ) ,10 .0 μm ol· L- 1 的 S1P使 Ca2 + 电流从给药前的 (0 .2 4 2± 0 .0 30 ) m V增加到(0 .36 4± 0 .0 6 0 ) m V (P<0 .0 1) ,而加入 G-蛋白耦联受体阻断剂 PTX后 ,S1P对 Ca2 + 通道电流的作用与给药前比较差异无显著性。结论 :S1P通过与 G-蛋白耦联的细胞膜受体介导促进豚鼠心室肌细胞 Ca2 + 通道的开放 ,并具有一定的剂量依赖性。

不同培养条件对拟南芥根细胞膜片钳记录的影响

本文以沙培养法、蛭石培养法、土培养法、水培养法和MS培养基等不同的方法培养拟南芥(Arabidopsisthaliana),分析了不同培养方法对根生长发育的影响,并分别分离根的原生质体。在膜片钳记录中对不同来源的根原生质体状态进行了比较。结果表明,土培养法分离的原生质体最适于膜片钳记录。

单个人心房肌细胞的分离、鉴定及影响因素分析

目的探讨分离、鉴定单个人心房肌细胞的最佳方法及其影响因素。方法人心房肌组织取自5例先天性心脏病（PCHD）、8例冠心病（CHD）、15例瓣膜性心脏病（VHD）手术患者，采用两步酶解法分离制备心房肌细胞，光学显微镜下观察细胞形态，全细胞膜片钳技术记录乙酰胆碱敏感钾电流（Ik,Ach）情况。结果两步酶解法分离所得杆状、横纹清楚、折光性好、静止、贴壁良好的心肌细胞产率为30％～50％。PCHD记录Ik,Ach成功率最高（9／10个细胞），其次为CHD（6／10个细胞），VHD最低（3／10个细胞）。结论两步酶解法可用于人心房肌细胞的分离，全细胞膜片钳技术有助于细胞活性的鉴定，其分离数量和活性受酶解情况、年龄、病种等因素影响。

膜片钳全细胞记录法在研究谷氨酰胺转运蛋白分子机制中的应用

为了研究中性氨基酸转运蛋白-谷氨酰胺转运蛋白的结构与功能,采用膜片钳全细胞记录法测定谷氨酰胺转运蛋白2介导的电流.结果表明:谷氨酰胺转运蛋白诱导了底物氨基酸和Na+浓度依赖性电流,可用于测定底物氨基酸和Na+对转运蛋白的表观亲和常数Km,SNAT2野生型对丙氨酸的表观亲和常数KmA la为(200±5)×10-6mol/L,对Na+的表观亲和常数KmNa为(100±7)×10-3mol/L.谷氨酸转运蛋白转运底物氨基酸过程是生电的过程,在膜电势负值时氨基酸转运电流增大,可用于转运机制的研究.因此膜片钳全细胞记录法是研究谷氨酰胺转运蛋白分子机制的有效方法.

去甲肾上腺素对大鼠肝细胞延迟外向钾电流的影响

目前为止国内外尚未见到有关大鼠肝细胞外向钾电流方面的报道。本文用全细胞膜片宿制技术观察了大鼠肝细胞延迟外向钾电流（Ik）及去甲肾上腺素等对人的影响。实验结果表明，在保持电位-50mV、指令电位＋140mV时大鼠肝细胞Ik为2．85±1.21nA。去甲肾上腺素明显降低IK，异丙肾上腺素和乙酰胆碱对IK无影响。

QT对豚鼠单一心室肌细胞钙离子电流的影响

应用全细胞膜片钳制技术观察了QT村豚鼠单一心室肌细胞钙离子电流（Ica）的影响。结果显示：QT能明显增加心室肌细胞的Ca2+内流，使Ica增大。此作用有明显的电压依赖性，在峰电流电压下作用最明显，而对其反转电位无明显影响。在指令电位0mV时，浓度为500mg·L-1、lg·L-1、2g·L-1的QT分别使Ica增加9．5％、29．3％和523％（分别P＜0．10、P＜0．05、P＜0．01），EC50约1g·L-1。QT对Ica的作用具有可复性。上述结果揭示；QT以电压依赖和浓度依赖的方式增加心肌细胞的Ca2+内流，此作用可能是其治疗充血性心力衰竭的机制之一。

新型芳基吡唑脲类化合物的合成及活性评价

【目的】对氟虫腈结构进行衍生改造,寻找作用于昆虫中枢神经系统的新型活性化合物,为新杀虫剂的开发提供实践经验和理论指导。【方法】运用中间体衍生化策略,以氟虫腈为原料,经2步反应合成6个新型芳基吡唑脲类化合物(2a^2f),MS、~1H NMR和^(13)C NMR分析确认化合物2a^2f的结构;采用浸叶法测定目标化合物对3龄小菜蛾幼虫的生物活性;利用膜片钳技术检测目标化合物对昆虫中枢嗅觉神经元的毒性作用方式。【结果】生测结果表明化合物2a毒力最大,12 h LC_(50)值为6.17μg·mL^(–1);电生理数据显示,化合物2b、2d、2e、2f对神经元的作用方式不同于母体化合物,呈现出神经元膜电位短暂去极化,继而膜电位逐渐超级化,并伴随自发电活动被抑制。【结论】在具有生物活性的分子上引入酰胺脲键,是改变农药对昆虫中枢神经系统毒性作用方式的潜在策略,对新农药创制具有一定指导意义。

小直径DRG神经元上表达的电压门控离子通道特性

目的建立一种简单易行,满足多种药理学实验需要的大鼠DRG神经元急性分离方法,探讨大鼠DRG神经元的电生理特性。方法对160-220 g SD大鼠DRG神经元进行急性分离,并采用全细胞膜片钳技术记录电压门控离子通道钠电流、钙电流和钾电流。结果急性分离的大鼠DRG神经元呈圆形或椭圆形,胞质均一,折光性好,所表达的钠通道电流、钙电流和钾电流符合其电生理特性。结论运用该方法急性分离细胞操作简单易行,容易获得和辨认,电生理特征明确,适用于疼痛等疾病的电生理研究和相关药物的作用机制考察。

大鼠肝细胞外向钾电流的实验研究

目的：研究大鼠肝细胞上外向钾电流。方法：全细胞膜片钳制方法观察大鼠肝细胞延迟外向钾电流（Ｉｋ）和瞬间外向钾电流（Ｉｔｏ）及去甲肾上腺素等对Ｉｋ的影响。结果：正常细胞外液条件下，大鼠肝细胞在保持电位－５０ｍＶ，＋１４０ｍＶ刺激电压时Ｉｋ为（２．８５±１．２１）ｎＡ。应用改变保持电位（－８０ｍＶ和－３０ｍＶ）的方法。初步区分Ｉｔｏ和Ｉｋ，Ｉｔｏ值为（１．３９±０．５８）ｎＡ。结论：去甲肾上腺素明显降低Ｉｋ。

电生理膜片钳实验操作方法探讨

膜片钳技术是生命科学研究中的重要技术手段,利用膜片钳技术可以准确地记录到细胞膜上离子通道的电活动和囊泡的分泌特性。在神经科学方面,膜片钳技术有助于阐明神经元内部蛋白分子的生理活动和功能,探究相关疾病的分子机制并提供潜在的治疗方法。但是,膜片钳实验的操作却有一定难度,初学者需要经过系统学习和长时间练习才能很好地掌握操作方法。本文以最常见的电压钳全细胞模式为例,结合膜片钳的具体操作过程,陈述了实验操作中应该特别注意的一些细节和问题,以协助实验人员记录到有效的实验数据。

单离豚鼠内耳Deiters细胞的形态及电生理特性

目的 :分离豚鼠内耳活性良好的单离 Deiters细胞 ,观察其形态 ;探讨该细胞的基本电生理特性。方法 :采用酶孵育加机械分离法分离 Deiters细胞 ;利用膜电钳技术在全细胞模式下检测全细胞电容 ,记录在正常外液中的钾电流 ,零电流电位 ,反转电位 ,并根据相应公式计算离子通道 K+ 与 Na+ 的相对通透性比率 (PK/ PNa)及 K+平衡电位 (EK)。结果 :单离 Deiters细胞多呈逗点状 ,分为胞体 ,细柄和指突三部分 ,核靠近胞体中央 ,平均长度为(6 1.6± 2 0 ) μM(n=45 )。平均全细胞电容为 (2 7.5± 9.2 ) p F(n=2 8) ,零电流电位 (- 2 0± 1.8) m V(n=2 8) ,反转电位平均为 (- 6 4.3± 2 .9) m V(n =2 4) ,PK/ PNa=2 5 .4∶ 1,EK=- 84.2 m V。记录出 Deiters细胞在正常外液中的钾电流。结论 :根据 Deiters细胞的长度可以间接推断其在耳蜗中的位置 ,Deiters细胞离子通道具有高 K+ 选择性 。

钙激活性氯离子通道的电生理研究

目的:研究大鼠肺动脉平滑肌细胞上钙激活性氯离子通道的电流、电压电流关系等电生理特性。方法:采用急性酶分离法(胶原酶Ⅰ型和木瓜蛋白酶)分离出单个肺动脉平滑肌细胞,应用膜片钳技术,测定各组大鼠肺动脉平滑肌细胞上钙激活性氯离子通道电流和电压电流。结果:急性酶分离法能成功分离出适用于膜片钳记录的单个大鼠肺动脉平滑肌细胞,并测到稳定的钙激活性氯离子通道电流,该电流表现出时间、电压及钙离子依赖性,并呈外向整流特征。结论:大鼠肺动脉平滑肌细胞的钙激活氯离子通道具有时间依赖性、钙离子依赖性和电压依赖性,并具有外向整流特征。

人心房肌细胞分离方法的改良研究

目的探索改良的人心房肌细胞分离方法。方法采用两步酶消化法急性分离人心房肌细胞,采用膜片钳全细胞记录技术记录小电导钙激活钾通道。结果该分离方法可获得数量较多的心房肌细胞,窦性心律患者可获得完整有横纹细胞320±30,慢性房颤患者可获得完整有横纹细胞230±20,比较差异有统计学意义(P<0.01)。该方法可获得大量形态完整,横纹清晰的单个人心房肌细胞,且能在所分离的心房肌细胞上记录到典型的小电导钙激活钾通道电流。结论该试验所采用的分离方法简便,稳定有效,可获得细胞数量多和细胞质量好的单个人心房肌细胞。

用于膜片钳记录的成年大鼠脊髓切片方法

离体脊髓切片是医学研究生电生理科研实验中常用的活体组织。传统脊髓切片方法已沿用多年,由于实验技术条件所限,该方法仅适用于幼鼠。本实验室对传统实验方法进行了多项优化,包括加入心脏灌注手术,简化取髓剥膜步骤,改变溶液配方等措施。改进后的实验方法在一定程度上提高了神经元的活性,并在成年大鼠脊髓切片上成功地进行膜片钳记录。