E型牛肠道病毒新疆BL311株的分离鉴定及致病性分析

以采集自新疆博乐某牛场腹泻牛的粪便,接种胎牛肾细胞(Madin-Darby bovine kidney,MDBK),盲传15代分离牛肠道病毒(Bovine enterovirus,BEV),使用蚀斑纯化法连续纯化5轮得到纯化病毒,并命名为BL311。使用BL311株感染MDBK细胞后,观察细胞病变效应(cytopathic effect,CPE),采用Reed-Muench法计算病毒滴度,利用理化性质检测、透射电镜观察、基因型分析及对小鼠的致病性试验鉴定BL311分离株。结果显示,BL311分离株感染MDBK细胞24 h后细胞出现变圆、破裂和脱落等致细胞病变效应,病毒滴度显著增高(P<0.05);36 h后细胞出现大量CPE,病毒滴度极显著增高(P<0.01)。理化性质鉴定结果显示BL311分离株对有机溶剂具有一定抵抗力,紫外光照射1 h或56℃环境培养1 h可使毒株失活。电镜下观察BL311毒株为直径25~30 nm的球形颗粒,具有典型的小RNA病毒粒子形态。基因测序结果显示BL311毒株的基因全长是7514 nt,与国内报道的HY12分离株(KF748290)的同源性高达99%,属于BEV-E3型。致病性实验结果显示,BALB/c小鼠感染BL311毒株后,器官表现为肿大,且伴有出血;病理组织学观察可见组织器官炎性细胞浸润及出血。本研究分离纯化得到1株具有较强致病性的E种肠道病毒,将为新疆BEV的流行病学调查及致病机制研究提供依据。

布朗李炭疽病的病原鉴定及药效试验

采用实地调查和室内试验相结合的方法 ,对布朗李炭疽病在湖南的分布、危害、症状特点等进行了研究。根据布朗李炭疽病病原菌形态、培养特性和致病性 ,鉴定其有性世代为Glomerellacingulata ,无性世代为Colletotrichumgloeosporioides。药效试验表明 ,抑制病菌菌丝生长效果较好的化学药剂有湘研植病灵WP、70 %甲基硫菌灵WP、5 0 %多菌灵WP、扑菌特WP、4 0 %菌克星WP、5 0 %退菌特WP、6 0 %炭必灵WP、70 %红杀WP以及 1∶1∶10 0波尔多液 ;抑制孢子萌发效果较好的化学药剂有 70 %代森锰锌WP、扑菌持WP、70 %甲基硫菌灵WP、4 5 %石硫合剂WP、5 5 %疫霜锰锌WP、5 0 %退菌特WP和 1∶1∶10 0波尔多液。

河南烟草镰刀菌的分子鉴定及致病性分析

为明确河南省不同烟叶产区危害烟草的镰刀菌种类,以河南省烟叶产区典型镰刀菌根腐病烟株及烟田土壤为供试样品,采用组织分离法和土壤分离法获得纯化菌株,根据菌株形态和r DNA-ITS序列分析对病原菌进行鉴定,并采用无创接种法测定病原菌对烟草的致病性。结果表明,获得的98个菌株在PDA培养基上均产生白色菌丝,大型分生孢子呈镰刀形或马特形,无色、多孢;小型分生孢子呈肾形、椭圆形或卵形,无色、多无分隔。序列比对结果显示,所分离的98株菌分属尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、茄病镰刀菌(Fusarium solani)、层出镰刀菌(Fusarium proliferatum)、木贼镰刀菌(Fusarium equiseti)和Fusarium nematophilum。致病性分析结果表明,尖孢镰刀菌、茄病镰刀菌、层出镰刀菌和木贼镰刀菌对烟苗具有致病性;48株致病菌中豫南烟区烟草镰刀菌根腐病致病性病原菌为尖孢镰刀菌、层出镰刀菌和木贼镰刀菌,以尖孢镰刀菌为主;豫中为尖孢镰刀菌;豫东、豫西为茄病镰刀菌和尖孢镰刀菌。因此,尖孢镰刀菌为全省烟区重点防控对象,豫南烟区还需加强层出镰刀菌和木贼镰刀菌的防控,豫东、豫西需防范茄病镰刀菌的发生。

烟草镰刀菌根腐病的病原鉴定

为了探明烟草镰刀菌根腐病的病原菌分类地位,2015—2017年从福建省三明市主要烟区采集的烟草根腐病病样中分离获得31个镰孢菌属菌株(F1~F31)。对所分离的菌株进行形态学甄别、系统进化分析、种特异分子鉴定及致病性测定,结果表明分离菌株显微形态特征与尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)和共享镰刀菌(F.commune)相似;采用贝叶斯法(Bayesian Analysis)对4株分离菌F-04、F-18、F-19和F-28的rDNA基因内间隔区(IGS)基因作系统发育分析,结果显示这4个菌株同F.commune聚为一类并与F.oxysporum明确区分;特异性引物扩增鉴定结果表明分离菌株均为F.commune。通过室内与田间接种试验验证了分离菌株F.commune的致病性,明确其为烟草根腐病的主要病原物,这是我国首次报道共享镰刀菌F.commune引起烟草根腐病。

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒SHxx13/2013株的分离与鉴定

2013年初上海某猪场保育猪群中出现高热、呼吸障碍等临床表现,导致大部分发病猪死亡,为了确定此次猪群中爆发疫病的病原,本研究从发病猪群中随机采集了15份血液样品,利用RT-PCR方法对本次疫病病原进行了检测。结果显示,有11份临床样品呈现猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)强阳性,且与高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(Highly pathogenic Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,HP-PRRSV)对照大小相一致。随后从阳性样品中选取SHxx13/2013在Marc-145细胞中进行病毒的分离与鉴定,结果显示SHxx13/2013在细胞接种后第1代即出现明显的细胞效应(cytopathic effect,CPE),其病变特征与高致病性PRRSV强毒HuN4株一致。对SHxx13/2013第5代细胞分离毒进行RT-PCR和IFA等特异性鉴定,结果显示该毒株为PRRSV分离株,其蚀斑形态和生长特性与强毒HuN4株相似。分段克隆该毒株全长基因进行测序和序列分析,结果显示,新分离的流行毒SHxx13/2013株全长基因组为15 319 bp,其Nsp2基因特征与HP-PRRSV一致,在第482位和第534~562位发生两处共30个氨基酸的不连续缺失,且该毒株与高致病性PRRSV代表毒株HuN4亲缘关系较近,全长基因的核苷酸同源性为99.6%。本研究结果表明新分离的SHxx13/2013株属于高致病性PRRSV分离株,据此我们推测今年年初上海某猪场爆发的疫情主要是由HP-PRRSV感染所致。

鸡致病性大肠杆菌16SrRNAPCR鉴定方法的建立

为了建立一种鸡致病性大肠杆菌的快速检测方法,本试验通过无菌采集疑似感染致病性大肠杆菌鸡的心、肝、脾、肾作为病料,经过细菌分离培养、生化鉴定和致病力试验,利用大肠杆菌16S rRNA通用引物对3株致病菌进行PCR扩增,均得到了特异性扩增产物。并对扩增产物进行核酸测序和BLAST比对。结果显示,分离得到3株鸡致病性大肠杆菌(DZMG、DGCG1、DGCP3),扩增出的16S rRNA基因序列与鸡致病性大肠杆菌基因序列同源性为100%。提示该检测方法具有特异性高和简单快捷的特点。

2株猪繁殖与呼吸综合征病毒的致病性分析

为追踪猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)分离株的变异特点,本研究于2016年从河北和福建疑似猪繁殖与呼吸障碍综合征(PRRS)发病猪场采集病料,接种Marc-145细胞,产生合胞体样细胞病变,RT-PCR和间接免疫荧光试验鉴定为HP-PRRSV,将其分别命名为PRRSV CZ16A和NP16A。为研究PRRSV分离株CZ16A和NP16A对猪的致病性,将分离毒株经噬斑纯化后分别接种PRRSV抗原、抗体双阴性的60日龄健康仔猪,通过临床观察、解剖病理变化及病毒血症检测等指标初步探讨两株PRRSV的致病性。结果表明,分离株CZ16A和NP16A感染猪后均能够在动物体内复制,并引起体温升高,但两株PRRSV分离株均未引起试验动物的发病和死亡,剖检结果显示NP16A分离株能引起动物肺部实变、淋巴结肿大,其毒力比CZ16A分离株稍强。

海南茄子根结线虫病原鉴定及抗性砧用种质筛选

为明确海南基地茄子根结线虫病原种类并筛选抗病砧用茄子种质,采用形态学和r DNA-ITS分子生物学鉴定病原线虫种类,通过病土苗期鉴定与田间病圃诱发鉴定2种方法对58份砧用茄子种质进行抗性筛选。结果表明,具有方形背弓的南方根结线虫检出频率为93.33%,而花生根结线虫检出频率为6.67%;NCBI数据库比对分析显示,用南方根结线虫特异性引物扩增的序列与南方根结线虫KP411871.1的一致性为99.89%,用花生根结线虫特异性引物扩增的序列与花生根结线虫MW315990.1的一致性为99.76%;因此,确定南方根结线虫是侵染海南茄子的优势类群。2种方法鉴定参试茄子种质的根结线虫整体病情程度基本一致,苗期鉴定的总病情指数高于田间鉴定,筛选出高抗根结线虫砧用茄子种质6份,分别为水茄、蒜芥茄、LJ-7、Ng1-039、Ng1-021、Ng1-003。

菜豆菌核病病原菌的分离鉴定及防治药剂筛选

为明确黑龙江省菜豆菌核病病原菌种类,以菜豆菌核病病株上分离获得的菌株LMH-001为试验材料,检测其致病性,结合形态学特征与ITS序列分析对该病原菌进行分类鉴定,并通过室内毒力试验筛选对该病原菌具有抑制作用的杀菌剂。结果表明,供试病原菌LMH-001为核盘菌〔Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary〕,菌丝生长和菌核产生的最适培养基为PDA,温度为20~25℃,pH为6,碳源为葡萄糖,氮源为酵母粉;11种杀菌剂中,30%肟菌酯·戊唑醇悬浮剂对该病原菌的抑制效果最强,EC50值为0.1169μg·L^(-1),可作为防治菜豆菌核病的首选药剂,29%戊唑·嘧菌酯悬浮剂、25%吡唑醚菌酯悬浮剂、40%菌核净可湿性粉剂也有较好的抑制效果,4种杀菌剂可交替使用。

致犊牛腹泻大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验

[目的 ]了解新疆第六师规模奶牛场犊牛腹泻大肠杆菌致病性、血清型分布及药物敏感性。[方法 ]对从第六师部分奶牛场采集的296份腹泻犊牛肛拭样品,进行了鉴别培养、一系列生化试验、血清型鉴定、药敏试验等。[结果 ]分离到的192株埃希氏大肠杆菌中,表现β型溶血的83株;83株β型溶血大肠杆菌中,造成小鼠发病死亡的74株;对头孢他啶、阿奇霉素、诺氟沙星、恩诺沙星、氟苯尼考敏感性分别为100%、85.14%、70.27%、64.86%、63.51%;101团、103团、共青团农场、军户农场、奇台农场优势血清型分别为O101、O78、O141、O44、O15。[结论 ]该地区分离出的致病性大肠杆菌对头孢他啶、阿奇霉素、诺氟沙星、恩诺沙星、氟苯尼考有较大的敏感性,对其他抗生素均产生不同程度的耐药性,不同地区具有不同的优势血清型。

猪源化脓隐秘杆菌分离的鉴定与病原特性研究

从天津地区某猪场病猪肺脏脓肿中分离到一株具有β溶血特性的细菌,经形态学与生化特性分析,初步确定为化脓隐秘杆菌(Arcanobacterium pyogenes),并命名为TJjh1913。利用PCR扩增16S rRNA基因,经Blast序列分析,其序列与GenBank数据库中猪源化脓隐秘杆菌的核苷酸序列同源性高达99.9%,证实该分离株为猪化脓隐秘杆菌;该菌携带Plo、NanH、CbpA 3种毒力基因,动物实验表现出较强致病性,昆明系小鼠LD50为105 CFU;药敏试验结果显示,该菌对头孢类及喹诺酮类药物高度敏感,对氨基糖苷类药物耐药。本研究结果为猪化脓隐秘杆菌的鉴定及其流行病学调查与防治提供了参考依据。

大熊猫源停乳链球菌类马亚种的分离与鉴定

为研究引起大熊猫脚掌化脓感染的原因,有效防治该病,对大熊猫感染部位的浓汁进行了细菌学检查及分离,对分离菌进行形态特征、理化特性鉴定、兰氏分群以及16S rDNA序列的分子鉴定,并构建系统发育树;对分离菌进行健康小鼠的人工感染试验。结果分离到5株细菌,根据5株分离菌的形态特征、理化特性及兰氏分群结果,结合16S rDNA序列测定与系统发育分析结果,判定为链球菌属的停乳链球菌类马亚种。该分离菌对供试健康小鼠有较强的致病作用。证实分离菌即为引起大熊猫脚掌化脓感染的病原菌。