慢性HBV感染者肝脏HBV cccDNA含量相关因素分析

目的探讨慢性HBV感染者肝组织中HBV cccDNA含量与血清病毒标志物、HBV DNA及肝脏病理分级的关系,为临床评价抗病毒治疗效果及疗程确定提供理论依据。方法以2007年5月-2008年2月住院的30例慢性HBV感染者为研究对象,应用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测患者肝组织中HBV cccDNA、肝组织总HBV DNA(HBV tDNA)和血清HBVDNA,同时用化学发光免疫分析法检测HBsAg、HBeAg定量,分析感染者肝组织内HBV cccDNA与肝组织内HBV DNA、血清HBVDNA、HBsAg及HBeAg定量水平之间的关系,并比较肝组织中HBV cccDNA含量与肝脏病理炎症和纤维化分级的关系。采用Pear-son简单相关和Spearman等级相关法进行相关性分析。结果 30例慢性HBV感染者肝组织中均可检出HBV cccDNA,范围在3.15×103～1.06×107拷贝/mg;肝组织cccDNA定量与肝组织总HBV DNA定量呈正相关(r=0.375,P<0.05),与血清HBV DNA无相关性(r=0.174,P>0.05);肝组织中HBV cccDNA水平与血清HBsAg定量呈高度正相关(r=0.562,P<0.001),而与血清HBeAg定量无相关性(r=0.152,P>0.05)。肝组织cccDNA定量与肝组织炎症活动度(G)及纤维化程度(S)无相关性(r=0.082,P>0.05)。结论慢性HBV感染者肝组织内HBV cccDNA成稳定的中等水平复制;血清HBV DNA载量不能直接代表其肝组织中的HBV cccDNA水平;血清HBsAg定量可作为反映肝组织中HBV cccDNA水平的指标。

慢性乙型肝炎患者肝组织HBV cccDNA、总HBV DNA与血清HBV DNA的相关性及其与临床的关系

目的探讨慢性乙型肝炎患者肝组织HBV共价闭合环状DNA（cccDNA）、肝组织总HBV DNA（HBV tDNA）与血清HBV DNA之间的相关性及其与临床的关系。方法78例慢性乙型肝炎患者入选本研究。肝组织β—globin DNA、HBV cccDNA和HBV tDNA采用实时荧光定量PCR方法检测，平均每个肝细胞HBV cccDNA和HBV tDNA含量（拷贝／cell）=HBV cccDNA（实测值）／β-globin DNA（实测值）和HBV tDNA（实测值）／β-globin DNA（实测值），肝组织HBV cccDNA和HBV tDNA含量的计算单位定义为log10拷贝／10^6 cell；采用实时荧光定量PCR、ELISA法检测血清HBV DNA和HBV标志物；采用免疫组织化学方法检测肝细胞中HBsAg和HBcAg的表达。统计分析采用pearson相关分析及t检验。结果（1）肝组织HBV cccDNA与HBV tDNA定量呈正相关（r=0．696，P〈0．001）；肝组织HBV cccDNA与血清HBV DNA定量呈正相关（r=0．304，P％0．01）；肝组织HBV tDNA与血清HBV DNA定量呈正相关（r=0．341，P〈0．01）；（2）肝细胞内HBcAg定性检测阳性患者的血清HBV DNA定量明显高于阴性患者，且差异有统计学意义（P〈0．05）；肝细胞内HBcAg定性检测阳性患者与阴性患者的肝组织HBV cccDNA和HBV tDNA定量差异均无统计学意义和（P均〉0．05）；（3）肝细胞内HBsAg定性检测阳性患者的血清HBV DNA定量明显高于阴性患者，且差异有统计学意义（P〈0．05）；肝细胞内HBsAg定性检测阳性患者与阴性患者的肝组织HBV cccDNA和HBV tDNA定量差异均无统计学意义（P〉0．05）；（4）HBeAg（＋）／抗HBe（-）患者血清HBV DNA定量明显高于HBeAg（-）／抗-HBe（＋）患者，且差异有统计学意义（P〈0．05）；HBeAg（＋）／抗-HBe（-）患者肝组织HBV cccDNA和HBV tDNA定量与HBeAg（-）／抗-HBe（＋）患者比较差异均无统计学意义（均P〉0.05）；（5）肝组织HBV cccDNA、HBV tDNA以及血清HBV DNA三者与肝脏炎症活动度及纤维化程度均无显著相关性（P〉0．05）。结论（1）血清HBV DNA定量结果并不一定能完全反映患者肝组织中HBV cccDNA和HBV tDNA含量，尤其在血清HBV DNA％500拷贝／mL时，肝组织中仍存在HBV cccDNA和HBV tDNA，且含量大小不等。（2）肝细胞内HBcAg定性检测阳性或者HBsAg定性检测阳性患者的血清HBV DNA定量均明显高于阴性患者；而两者的肝组织HBV cccDNA和HBV tDNA定量均没有显著差异；（3）HBeAg（＋）／抗-HBe（-）患者血清HBV DNA定量明显高于HBeAg（-）／抗-HBe（＋）患者，而两者的肝组织HBV cccDNA和HBV tDNA均没有显著差异；（4）肝组织HBV cccDNA、HBV tDNA及血清HBV DNA与肝脏炎症活动度和纤维化程度均无显著相关性。

QIAGEN实时PCR与COBASTaqMan检测血清HBVDNA预测慢性乙型肝炎肝组织病理状态的性能比较

目的比较QIAGEN实时PCR与COBAS TaqMan检测血清HBV DNA水平预测慢性乙型肝炎肝组织病理状态的性能。方法慢性乙型肝炎患者278例,其中HBeAg阳性和阴性分别为162例和1 16例。采用QIAGEN实时定量PCR和COBAS TaqMan系统检测血清HBV DNA。肝组织病理学诊断采用Scheuer评分系统,其中病理学分级和分期包括G0~G4和S0~S4。结果血清HBV DNA（QIAGEN）和HBV DNA（C（）BAS）在HBeAg阳性患者G2与G3,S1、S2、S3与S4之间的差异有统计学意义（P均〈0.05）;在HBeAg阴性患者G1与G2、G3,S1与S2、S3、S4之间的差异有统计学意义（P均〈0.05）。血清HBV DNA（QIAGEN）与HBV DNA（COBAS）定量的不一致率,在HBeAg阳性患者G1-2、G3和S1-3、S4分别为4.24%（5/1 18）、9.09%（4/44）和3.68%（5/136）、7.69%（2/26）,在HBeAg阴性患者G1、G2-3和S1、S2-4分别为6.02%（5/83）、3.03%（1/33）和3.29%（2/61）、3.64%（2/55）。血清HBV DNA（QIAGEN）和HBV DNA（COBAS）预测HBeAg阳性患者≥G3、≥S4的ROC曲线下面积分别为0.645和0.695、0.703和0.755,预测HBeAg阴性患者≥G2、≥S2的ROC曲线下面积分别为0.848和0.817、0.756和0.756。血清HBV DNA（QIAGEN）和HBV DNA（COBAS）预测HBeAg阳性患者≥S4的最佳截断值分别为≤3.784×10~6 IU/mL和≤6.668×10~7IU/mL,对应的灵敏度、特异度分别为0.654和1.000、0.735和0.581;预测HBeAg阴性患者≥G2的最佳截断值分别为≥5.821×10~3IU/mL和≥9.311×10~3 IU/mL,对应的灵敏度、特异度分别为0.970和0.909、0.614和0.651。结论血清HBV DNA预测肝组织病理状态的特点为预测HBeAg阴性患者≥G2的效能最大,并且血清HBV DNA（QIAGEN）与HBV DNA（COBAS）预测HBeAg阴性患者≥G2的性能有高度一致性。

血清HBsAg、HBcrAg和HBV DNA预测慢性乙型肝炎肝组织病理状态的性能评价

目的评价血清HBsAg、HBcrAg、HBV DNA预测慢性乙型肝炎肝组织病理状态的性能。方法将324例HBeAg阳性和255例HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者随机分为3组匹配的训练集和验证集。血清HBsAg和HBcrAg分别采用Abbott Architect I2000和Fujirebio Lumipulse G1200全自动化学发光免疫系统检测,血清HBV DNA采用Bio-Rad Icycler荧光定量PCR仪检测。肝组织病理学诊断采用Scheuer评分系统,其中病理学分级包括G0~G4五级,分期包括S0~S4五期。结果无论HBeAg阳性或阴性患者,3个训练集与3个匹配的验证集性别比例和平均年龄、病理学分级和分期构成比之间的差异均无统计学意义（P〉0.05）。HBeAg阳性患者,血清HBsAg、HBcrAg、HBV DNA预测全集病理学分级≥G3和分期≥S4的ROC曲线下面积最大;参照预测3个训练集病理学分级≥G3和分期≥S4的最佳截断值,血清HBsAg、HBcrAg、HBV DNA预测3个匹配的验证集病理学分级≥G3和分期≥S4的灵敏度极差分别为37%和9%、30%和16%、17%和14%,特异度极差分别为12%和5%、13%和3%、15%和6%。HBeAg阴性患者,血清HBcrAg、HBV DNA预测全集病理学分级≥G2和分期≥S2的ROC曲线下面积最大;参照预测3个训练集病理学分级≥G2和分期≥S2的最佳截断值,血清HBcrAg、HBV DNA预测3个匹配的验证集病理学分级≥G2和分期≥S2的灵敏度极差分别为11%和20%、46%和19%,特异度极差分别为15%和2%、38%和16%。结论 HBeAg阳性患者,血清HBsAg、HBcrAg、HBV DNA可预测的最佳病理状态为病理学分级≥G3和分期≥S4,其预测理学分期≥S4的稳定性高于预测病理学分级≥G3;HBeAg阴性患者,血清HBcrAg和HBV DNA可预测的最佳病理状态为病理学分级≥G2和分期≥S2,血清HBcrAg预测病理学分级≥G2和分期≥S2的稳定性高于HBV DNA。

慢性乙型肝炎血清HBV DNA载量与肝组织病理的关系

目的探讨HBeAg阳性和HBeAg阴性慢性乙型肝炎血清HBV DNA载量与肝组织炎症活动度、纤维化程度之间的关系。方法分别对103例HBeAg阳性和81例HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者肝脏穿刺活检,进行肝组织炎症活动度分级和纤维化程度分期,同期检测血清HBV DNA载量,并分析两者之间的关系。结果 103例HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者血清HBV DNA载量与肝组织炎症活动度、纤维化程度均无明显相关性(r=0.125,P>0.05;r=0.164,P>0.05)。81例HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者血清HBV DNA载量与肝组织炎症活动度、纤维化程度均呈正相关(r=0.326,P<0.01;r=0.267,P<0.05)。结论 HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者血清HBV DNA载量能反映肝组织炎症活动度和纤维化程度,可作为抗病毒药物选择和疗效观察的指标。

血清HBVDNA定量与肝组织病理的相关性研究

目的明确慢性乙型病毒性肝炎(CHB)患者血清HBV DNA定量与肝组织炎症活动度及肝纤维化分期之间的关系。方法 CHB患者223例分成HBeAg阴性和阳性两组,应用PCR检测血清HBV DNA,同时行肝组织病理检查明确肝组织炎症活动度和肝纤维化分期。结果 (1)HBeAg阳性组不同肝组织炎症活动度分级之间的HBVDNA无明显的差别(P>0.05),而且二者无明显相关性(rs=-0.073,P>0.05);不同肝纤维化分期之间的HBVDNA也无明显的差别(P>0.05),而且二者也无相关性(rs=-0.113,P>0.05)。(2)HBeAg阴性组不同肝组织炎症活动度分级之间的HBVDNA有明显的差别(P<0.05),而且二者呈正相关(rs=0.327,P<0.01);不同肝纤维化分期之间的HBVDNA也有明显的差别(P<0.05),而且二者也呈正相关(rs=0.314,P<0.01);随着肝组织炎症分级和肝纤维化分期的增加,HB-VDNA进行性增高。结论 HBeAg阴性CHB患者的血清HBV DNA定量与肝组织炎症活动度及肝纤维化分期具有良好的一致性;HBeAg阳性CHB患者的HBV DNA定量不能反映肝组织病理情况。

肝组织HBV总DNA和cccDNA阴性参考值的探讨

目的探讨肝组织乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）总DNA（total DNA,tDNA）和共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA,cccDNA）的阴性参考值,为进一步研究实时定量PCR检测肝组织HBV tDNA和cccDNA的应用价值奠定基础。方法分别有88例HBsAg阳性/抗-HBc阳性、20例HBsAg阴性/抗-HBc阳性和19例HBsAg阴性/抗-HBc阴性慢性肝炎患者入选本研究。肝组织β-globin DNA、HBV tDNA和cccDNA采用实时荧光定量PCR检测,单个肝细胞HBV tDNA和cccDNA含量（copies/cell）=HBV tDNA实测值（copies）/β-globin DNA实测值（copies）和HBV cccDNA实测值（copies）/β-globin DNA实测值（copies）。肝组织HBVtDNA和cccDNA含量的计算单位定义为log_（10）copies/10~6cell。统计分析采用SPSS 13.0软件。结果肝组织HBVtDNA和cccDNA鉴别HBsAg阳性/抗-HBc阳性与HBsAg阴性/抗-HBc阴性慢性肝炎的ROC曲线下面积分别为0.909和0.891（P=0.000和0.000）,最佳截断值分别为5.772和4.883 log_（10） copies/10~6cells;鉴别HBsAg阳性/抗-HBc阳性与HBsAg阴性/抗-HBc阳性慢性肝炎的ROC曲线下面积分别为0.893和0.857（P=0.000和0.000.）,最佳截断值分别为5.559和4.630 log_（10） copies/10~6cells。就HBsAg阳性/抗-HBc阳性慢性肝炎而言,当肝组织HBV tDNA和cccDNA≥5.699和cccDNA≥4.699 log_（10） copies/10~6cells时,肝组织HBV tDNA与cccDNA含量之间均呈显著正相关（P=0.000和0.000）;当肝组织HBV tDNA〈5.699和cccDNA〈4.699 log_（10） copies/10~6cells时,肝组织HBV tDNA与cccDNA含量之间均无显著相关性（P=0.065和0.880）。结论肝组织HBV tDNA〈5.699和cccDNA〈4.699 log_（10） copies/10~6cells可能是合适的阴性参考值。

慢性乙型肝炎患者肝组织病理学分析

目的探讨慢性乙型肝炎患者肝组织病理学与临床血生化指标的相关性。方法对252例慢性乙型肝炎患者肝穿活组织病理学检查结果与血清HBVDNA、肝功能等血生化指标进行统计学分析。结果肝组织炎症活动度与纤维化分期无明显的相关性(rs=-0.132,P=0.579);肝组织G4期患者血清ALT和PT水平明显高于G1期患者(P<O.05);血清HBVDNA水平与肝组织炎性活动度和纤维化程度无明显的相关性(P>0.01)。结论肝组织活检在肝脏病情评估中的作用是其它检查所不能代替的。

41例肝功能正常的HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者肝组织病理学及临床特点分析

目的:对肝功能正常的HBeAg阴性慢性乙型肝炎(CHB)患者的肝组织病理结果与临床指标进行分析与研究。方法:将2018年2月-2019年2月到我院接受治疗的41例肝功能正常的HBeAg阴性CHB患者选取为研究对象,对患者采取肝功能、HBsAg及HBV DNA检测,并对患者的肝组织病理结果进行分析。结果:在41例肝功能正常的HBeAg阴性CHB患者中,年龄与血清HBsAg呈负相关关系(P<0.05);肝组织炎症与肝纤维化分期呈显著正相关关系(P<0.01)。按照炎症分级分组比较:炎症程度<G2与炎症程度≥G2比较,随着HBV DNA水平的上升,肝组织炎症有加重的趋势;组间年龄、血清HBsAg、HBV DNA差异无统计学意义(均P>0.05);按照纤维化分期分组比较:纤维化分期<S2与纤维化分期≥S2比较,组间年龄、血清HBsAg、HBV DNA差异无统计学意义(均P>0.05)。结论:对肝功能正常的HBeAg阴性CHB患者需及早进行肝组织穿刺活检术明确肝脏炎症及纤维化情况,进一步评估病情明确治疗方案,对防治CHB的疾病进展有着十分重要的意义。

石蜡包埋肝组织乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA的检测及临床意义研究进展

目前全世界约有3.5亿慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染者[1],每年有约100万人死于乙型肝炎(乙肝)相关肝硬化或肝癌[2]。HBV感染者的临床表现多样化,病毒和疾病活动程度不一,但持续感染的主要原因是肝细胞核内HBV共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)的存在。HBV cccDNA是HBV复制过程中的重要中间体,是HBV mRNA和前基因组RNA(pgRNA)的合成模板及病毒持续感染的关键因素[3-7]。HBV cccDNA半衰期长,不易降解。

应用石蜡包埋肝组织HBV tDNA和cccDNA定量优化法检测乙型肝炎相关肝癌患者

目的对石蜡包埋肝组织核酸提取法进行优化,提高石蜡包埋肝组织乙型肝炎病毒总的去氧核糖核酸(HBV tDNA)、共价闭合环状去氧核糖核酸(cccDNA)定量检测的灵敏度,检测乙型肝炎(乙肝)相关肝癌患者的癌和癌旁组织中HBV tDNA、cccDNA。方法优化石蜡包埋肝组织核酸提取方法,采用荧光定量PCR法检测37例HBV感染相关肝细胞癌(HCC)患者石蜡包埋肝癌和癌旁组织中HBV tDNA、cccDNA。结果通过优化石蜡包埋肝组织核酸提取方法,核酸得量提高126.3%。HBV tDNA和cccDNA检出率在石蜡包埋肝癌组织中分别为100.0%(37/37)和97.3%(36/37),癌旁组织中均为100.0%(37/37)。HBV tDNA、cccDNA含量以及HBV cccDNA占tDNA的比例在肝癌组织与癌旁组织之间差异无统计学意义(P>0.05)。癌旁组织HBV tDNA与血清HBV DNA呈弱相关(r=0.380,P=0.020)。结论石蜡包埋肝组织核酸提取方法的优化可显著提高HBV相关的HCC患者癌和癌旁组织中HBV tDNA、cccDNA检出率。在癌旁组织中可100.0%检出HBV tDNA和cccDNA,建议对HCC切除术后的患者进行抗病毒治疗,以预防HBV感染相关HCC的复发。

HBeAg阳性与HBeAg阴性慢性HBV携带者肝组织病理结果分析

目的探讨HBeAg阳性与HBeAg阴性慢性HBV携带者肝组织病理学特征及临床意义。方法采用回顾性分析方法,收集2002年1月-2009年12月住院的198例HBeAg阳性与HBeAg阴性慢性HBV携带者,所有患者均进行肝穿刺组织活检,分析病理特征。结果 198例慢性HBV携带者HBeAg阳性134例(占67.68%),HBeAg阴性64例(占32.32%),除21例(占10.61%)无肝脏病理改变外,其余肝脏组织学显示不同程度炎症(G)及纤维化(S)改变者占89.39%(177/198),其中G1占65.66%(130/198),G2占19.19%(38/198),G3占4.55%(9/198),≥G2共占23.74%(47/198);S1占39.90%(79/198),S2占36.87%(73/198),S3占5.05%(10/198),S4占0.51%(1/198),≥S2共占42.42%(84/198)。男性组与女性组G、S比较差异均无统计学意义(P均>0.05);年龄≥30岁组G及S重于<30岁组(P<0.05)。病程<10年组与≥10年组G比较差异无统计学意义(P>0.05),病程≥10年组S重于<10年组(P<0.05)。按HBeAg分阳性组与阴性组,HBeAg阳性组以G1(占70.89%)、S1(占47.01%)为多,而HBeAg阴性组以≥G2(占34.38%)、≥S2(占56.25%)为多,差异有统计学意义(P<0.05)。HBeAg阳性组肝组织G各级之间及S各期之间血清HBVDNA水平比较差异均无统计学意义(分别为χ2=3.117,df=3,P=0.366;χ2=5.579,df=3,P=0.134);HBeAg阴性组肝组织G各级之间及S各期之间血清HBVDNA水平比较差异亦无统计学意义(分别为χ2=0.921,df=3,P=0.823;χ2=3.408,df=3,P=0.492)。结论无论HBeAg阳性或HBeAg阴性慢性HBV携带者绝大部分有一定的肝组织学改变,应引起足够重视;HBeAg阴性慢性HBV携带者的肝组织损害程度要重于HBeAg阳性者。肝组织学炎症、纤维化程度改变与乙肝病毒复制水平、性别无关。年龄≥30岁组炎症及纤维化程度重于<30岁组,病程≥10年组纤维化程度重于<10年组。年龄在30岁以上,病程超过10年的慢性HBV携带者应密切随访,及时进行肝活检,明确病情,并给予恰当的治疗。

死后离体人肝组织的激光共聚焦显微拉曼光谱分析

目的观察和探讨人死后肝组织细胞激光共聚焦显微拉曼光谱的变化规律及其与死亡时间的关系。方法离体肝组织于死后48～72h内每隔4h提取样品,采用激光共聚焦显微拉曼光谱技术进行检测。观察800cm-1～3 200cm-1范围内检测样本特征峰的变化,指认其对应的化学基团,选择强度比值I1094/I2923作为响应值,并进行统计学计算。结果在48～72h内,随时间的延长,肝组织细胞主要散射峰峰位无明显变化,而其峰强度有明显差异;与核酸有关的峰(1 094cm-1)强度随时间推移有明显下降;与脂类有关的峰(1 454cm-1、2 923cm-1)强度变化不明显;各相对峰强(I1094/I2923)随死亡时间的推移而减小,并得到回归方程(r=0.914)。结论人死后肝组织细胞DNA降解随死亡时间延长呈下降趋势,I1094/I2923值与PMI呈负线性关系。激光共聚焦显微拉曼光谱技术有望成为推断死亡时间的检测方法。