布氏杆菌抗原蛋白pbp39基因重组穿梭质粒的构建与鉴定

为构建融合表达PBP39-P276的E.coli-分枝杆菌穿梭载体,分别以布氏杆菌(Brucella abortus)基因组DNA和PMD 18-T-p276质粒为模板,通过PCR扩增得到约1206bp的pbp39抗原基因和276bp的p276基因序列,将pbp39基因与穿梭表达质粒pMV361重组,得到重组质粒pMV361-pbp39,再将p276基因序列克隆至pMV361-pbp39中,得到重组质粒pMV361-pbp39-p276。质粒pMV361-pbp39-p276经PCR扩增鉴定证实,克隆基因pbp39和抗原基因p276正确插入载体pMV361。重组质粒pMV361-pbp39-p276可望在卡介苗(BCG)中分泌性表达布氏杆菌的免疫保护性抗原蛋白PBP39-P276,该质粒的构建成功为发展新型布氏杆菌疫苗奠定了基础。

布氏杆菌PBP_(39)蛋白抗原表达及免疫效果的研究

目的 获得纯化的布氏杆菌PBP3 9重组蛋白抗原,观察PBP3 9重组蛋白的免疫原性。方法 扩增不同种布氏杆菌PBP3 9基因,测序、连接表达载体PET3 2a ,诱导表达,柱纯化PBP3 9重组蛋白抗原,免疫BALB/c小鼠,ELISA检测抗体及抗体亚型。结果 我国牛、羊、猪布氏杆菌PBP3 9基因与国外已报道的PBP3 9编码基因不完全相同。在蛋白N端5 8位碱基后多一G ,造成移码突变。故在85、86、87位编码终止子TCA。而在13 4、13 5、13 6位的ATG又编码了新的起始密码。布氏杆菌PBP3 9蛋白在大肠杆菌高效表达,表达量达40 % ,纯化重组蛋白抗原免疫BALB/c小鼠,产生了较高水平的特异性抗体免疫应答,抗体亚型主要是IgG1。结论 我国牛、羊、猪布氏杆菌PBP3 9编码抗原蛋白同国外已报道的不完全相同,纯化的PBP3 9重组蛋白抗原可诱导高水平的抗体反应,为筛选布氏杆菌病新型疫苗保护性抗原分子奠定了基础。

布氏杆菌PBP_(39)/pCDNATE重组表达质粒的构建及免疫效果的研究

目的构建PBP39/pCDNATE重组表达质粒,免疫BALB/c小鼠观察诱导的特异性体液免疫、细胞免疫及免疫保护效果。方法克隆PBP39基因,构建PBP39/pCDNATE重组表达质粒。首先转染Cos-7细胞,免疫组化检测其PBP39蛋白抗原的表达。然后用PBP39基因疫苗肌肉注射免疫BALB/c小鼠4次,观察特异性体液免疫和细胞免疫效果。进一步用1.25×104布氏杆菌544A强毒株腹腔攻毒,观察PBP39重组表达质粒的免疫保护效果。结果扩增的PBP39保护性抗原基因片段在牛、羊和猪布氏杆菌株中具有高度保守性,构建的PBP39/pCDNATE重组表达质粒在Cos-7细胞中有目的蛋白的表达。制备的PBP39重组表达质粒肌肉免疫BALB/c小鼠4次,ELISA检测PBP39重组表达质粒产生了较高水平的特异性IgG抗体,并随免疫次数增加抗体的滴度也递增,抗体亚型以IgG2a为主,表明诱导了TH1型的免疫应答。MTT测定PBP39重组表达质粒的淋巴细胞增殖能力与对照组差异有统计学意义。布氏杆菌A544强毒株攻毒后,动物存活及脾组织细菌数与对照组比较差异有统计学意义,说明PBP39重组表达质粒能够产生有效的保护效果。结论研制的PBP39重组表达质粒免疫BALB/c小鼠能产生高水平的特异性抗体和细胞免疫,且以细胞免疫为主,并产生有效的免疫保护效果,为布氏杆菌病新型疫苗的研究奠定了基础。