pcDNA3/HA-moesin^(T558A)和pcDNA3/HA-moesin^(T558D)基因突变体构建与验证

目的构建抑制型pcDNA3/HA-moesin^(T558A)与激活型pcDNA3/HA-moesin^(T558D)基因突变体,并在人脐静脉内皮细胞(HUVECs)中验证。方法设计特定的moesin^(T558A)、moesin^(T558D)基因突变引物,以pcDNA3/HA-moesin为模板,采用逆向PCR技术进行体外定点突变,以丙氨酸、天冬氨酸取代苏氨酸,获得抑制型pcDNA3/HA-moesin^(T558A)和激活型pcDNA3/HA-moesin^(T558D)基因突变体并测序。体外培养HUVECs,随机分为对照1组、pcDNA3/HA空载体组、pcDNA3/HA-moesin组以及对照2组、pcDNA3/HA-moesin^(T558A)组、pcDNA3/HA-moesin^(T558D)组,pcDNA3/HA空载体组、pcDNA3/HA-moesin组、pcDNA3/HA-moesin^(T558A)组、pcDNA3/HA-moesin^(T558D)组分别转染pcDNA3/HA空载体、pcDNA3/HA-moesin、pcDNA3/HA-moesin^(T558A)、pcDNA3/HA-moesin^(T558D),对照1组与对照2组不予转染。转染24 h,收集细胞,采用实时荧光定量PCR法检测moesin mRNA表达,采用Western blotting法和免疫荧光法检测moesin蛋白表达。结果经测序,目的基因moesin^(T558A)、moesin^(T558D)序列完全正确,第558位苏氨酸分别突变为丙氨酸、天冬氨酸,抑制型pcDNA3/HA-moesin^(T558A)和激活型pcDNA3/HA-moesin^(T558D)基因突变体构建成功。pcDNA3/HA-moesin组moesin mRNA相对表达量显著高于对照1组和pcDNA3/HA空载体组(t分别为16.688、16.649,P均<0.05),而pcDNA3/HA空载体组与对照1组比较差异无统计学意义(t=1.925,P>0.05)。pcDNA3/HA-moesin^(T558D)组、pcDNA3/HA-moesin^(T558A)组moesin mRNA相对表达量均显著高于对照2组(t分别为13.809、9.260,P均<0.05),pcDNA3/HA-moesin^(T558D)组与pcDNA3/HA-moesin^(T558A)组比较差异无统计学意义(t=2.364,P>0.05)。Western blotting结果显示,pcDNA3/HA-moesin^(T558A)组和pcDNA3/HA-moesin^(T558D)组均能观察到HA-moesin蛋白表达,而对照1组未观察到HA-moesin蛋白表达。免疫荧光结果显示,pcDNA3/HA-moesin组、pcDNA3/HA-moesin^(T558A)组和pcDNA3/HA-moesin^(T558D)组均能观察到HA-moesin荧光,而对照2组未观察到HA-moesin荧光。结论成功构建了抑制型pcDNA3/HA-moesin^(T558A)和激活型pcDNA3/HA-moesin^(T558D)基因突变体;经验证,这两种基因突变体均能促进moesin表达。

pCDNA3-AADC真核表达载体的构建及其在原代培养骨骼肌细胞中的表达

目的 将人类神经元性芳香族氨基酸脱羧酶（AADC）基因构建于含CMV启动子的真核表达载体pCD-NA3上,并检测其在原代培养骨骼肌细胞中的表达。方法 采用分子克隆技术将经测序证实的人神经元性AADC基因片段同真核表达载体pCDNA3连接,酶切鉴定并筛选出正向连接重组体,并采用脂质体转染法将其导入原代培养的骨骼肌细胞,免疫印记检测该基因的表达。结果 酶切证实基因片断正向连接于pCDNA3上,并在原代骨骼肌细胞中获得表达。结论 含人类神经元AADC基因的真核表达重组体可在原代培养的骨骼肌细胞中有效的表达。

核酸疫苗pcDNA3-γcC1诱导囊尾蚴细胞凋亡的作用

目的 :观察核酸疫苗 pc DNA3- γc C1免疫接种后动物宿主体内囊尾蚴的细胞凋亡现象 ,探讨治疗型核酸疫苗的作用机制。 方法 :分离、培养囊尾蚴混合细胞 ,用原位末端标记 (TUNEL)法分别检测免疫接种组、非接种组以及培养诱导对照组细胞凋亡情况。结果 :非接种组 ,且未经凋亡诱导的细胞核无凋亡所特有的阳性着色 ;经诱导或免疫接种组的细胞核均表现为极强的凋亡所特有的阳性着色。 结论 :首次观察到核酸疫苗接种后引起寄生生物细胞凋亡的现象 。

弓形虫和乙型肝炎病毒混合核酸疫苗的研究Ⅱ.pcDNA3-HBsAg-GRA1在COS-7细胞中的表达及鉴定

目的 鉴定pcDNA3 HBsAg GRA1在哺乳动物细胞内是否表达目的蛋白。 方法 提取pcDNA3 HBsAg GRA1质粒 ;体外培养COS 7细胞 ;pcDNA3 HBsAg GRA1经脂质体转染体外培养的COS 7细胞 ;取转染后的细胞培养上清进行SDS PAGE ,Western blot鉴定。结果 成功将pcDNA3 HBsAg GRA1转染入COS 7细胞。转染的细胞能高效表达分子为 4 7kD分泌性融合蛋白 (HBsAg GRA1)。HBsAg GRA1能同时被HBsAb阳性人血清及弓形虫免疫兔血清所识别。 结论 pcDNA3 HB sAg GRA1在体外培养的COS 7细胞中高效表达与预期分子量大小相同 ,且具有免疫学活性的融合蛋白。

抗血吸虫DNA疫苗pcDNA3／SjHGPRT局部肌肉刺激与全身过敏实验

目的评价日本血吸虫DNA疫苗pcDNA3/Sj HGPRT的安全性。方法同体左右侧自身对比法对3只家兔进行局部肌肉刺激实验,22只豚鼠随机分为4组:无菌生理盐水阴性对照组、牛血清白蛋白阳性对照组、pcDNA3/Sj HGPRT低剂量组、pcDNA3/Sj HGPRT高剂量组,进行全身过敏试验。结果日本血吸虫DNA疫苗pcDNA3/Sj HGPRT对家兔局部肌肉刺激反应轻微,对豚鼠无全身过敏反应。结论日本血吸虫DNA疫苗pcDNA3/Sj HGPRT在该实验条件下安全。

日本血吸虫DNA疫苗pcDNA3/SjSDISP的安全性评价

目的评价日本血吸虫DNA疫苗pcDNA3/SjSDISP的安全性。方法同体左右侧自身对比法对3只家兔进行局部肌肉刺激实验,22只豚鼠随机分为4组:A组为无菌生理盐水阴性对照组,B组为牛血清白蛋白阳性对照组,C组为pcDNA3/SjSDISP低剂量组,D组为pcDNA3/SjSDISP高剂量组,进行全身过敏实验。结果日本血吸虫DNA疫苗pcDNA3/SjSDISP对家兔局部肌肉刺激反应轻微,对豚鼠无全身过敏反应。结论日本血吸虫DNA疫苗pcDNA3/SjSDISP在该实验条件下安全。

重组PcDNA3.1-hBMP-2转染骨髓基质干细胞及复合异种骨支架体外构建组织工程骨

目的 :构建人骨形态发生蛋白 2 (humanbonemorphogeneticprotein ,hBMP 2 )真核表达载体PcDNA3 1 hBMP 2 ,转染兔骨髓基质干细胞 (bonemarrowstromalcells ,BMSCs) ,种植去抗原牛松质骨(bovinecancellousbone ,BCB)支架体外构建组织工程骨。方法 :蛋白印迹法检测转染后细胞BMP 2的表达 ,碱性磷酸酶 (ALPase)活性检测分析基因转染对细胞分化的影响。然后将转染后细胞接种到BCB支架上 ,扫描电镜观察细胞贴附、生长状况。结果 :转染后 ,BMSCs表达BMP 2 ,ALP活性明显增高。扫描电镜见转染细胞分布均匀 ,伸展良好。结论 :在脂质体介导下 ,BMP 2基因可导入细胞且稳定表达基因产物促进自身增殖分化 ,转染后细胞在支架材料上贴附生长良好 ,为进一步应用携带BMP

小鼠骨髓树突状细胞pcDNA3-hCEA转染疫苗的抗瘤作用

目的 :将pcDNA3 -hCEA转染小鼠骨髓树突状细胞 (DCs) ,观察其诱导BALB/c小鼠对CT2 6(hCEA+ )的抗肿瘤免疫效应。方法 :采用rmGM -CSF和rmIL - 4体外诱导培养小鼠骨髓DCs;构建真核表达质粒pcDNA3 -hCEA ;并用lipofectamine将其转染DCs,制备DCs(pCDNA3 -hCEA)疫苗 ;同时制备CT2 6(hCEA+ ) ;采用RT -PCR检测DCs(pCDNA3 -hCEA)中CEAmRNA的表达 ,采用放射免疫法检测DCs(pCDNA3 -hCEA)培养上清中CEA的含量 ;使用DCs(pCDNA3 -hCEA)疫苗体外诱导小鼠同种异体T淋巴细胞靶向性杀伤。采用DCs(pcDNA3 -hCEA)疫苗预防免疫BALB/c小鼠 ,观察其对于荷临界致瘤量CT2 6(hCEA+ )小鼠的抗肿瘤效应。结果 :经G41 8筛选 ,DCs(pCDNA3 -hCEA)有 1 4 %的获得率 ;RT -PCR检测表明DCs(pCDNA3 -hCEA)内CEAmRNA呈阳性表达 ;放射免疫法检测表明DCs(pCDNA3 -hCEA)能微量表达人CEA ;DCs(pCDNA3 -hCEA)能够有效诱导CEA靶向免疫杀伤。DCs(pcDNA3 -hCEA)疫苗延长荷CT2 6(hCEA+ )瘤小鼠生存期 1周至 4周。结论 :编码肿瘤抗原基因的真核表达质粒转染的树突状细胞 。

弓形虫pcDNA3-ROP1 DNA疫苗免疫小鼠诱导体液免疫应答及保护性的初步观察

目的观察弓形虫pcDNA3-ROP1DNA疫苗免疫BALB／C小鼠诱导其体内产生的体液免疫应答及抗虫感染的免疫保护作用．方法重组质粒用生理盐水稀释后，肌注免疫BALB／C小鼠．分别于免疫后5周和10周用ELISA法测定IgG抗体滴度；免疫鼠腹腔注射弓形虫速殖子攻击感染．结果经两次检测，均可测到特异性IgG抗体，且抗体的滴度随免疫时间的延长而增高；弓形虫速殖子腹腔攻击感染免疫组小鼠的平均存活时间较对照组延长，统计学有显著性差异（P〈0．01）．结论弓形虫pcDNA3-ROP1质粒DNA疫苗能诱导BALB／C小鼠产生特异性体液免疫应答及部分抗虫免疫保护作用．

人可溶性白介素-1受体真核表达载体pcDNA3/sIL-1R的构建

目的 本研究旨在构建人可溶性白介素_1受体 (sIL_1R)真核表达载体pcDNA3 sIL_1R ,为研究骨关节病的基因治疗奠定实验基础。方法 将人sIL_1R基因的RT_PCR纯化产物及质粒pcDNA3 1(+)DNA经KpnI和XhoI双酶切、胶回收纯化酶切片段后 ,体外连接酶切片段 ,使其定向重组 ,再将重组DNA转化E .coliCompetentCellsJM10 9,经复苏后 ,在含Ampr 的LB固体培养基上筛选出阳性克隆。结果 挑取的LB固体培养基上的 6个单菌落经酶切及测序鉴定 ,证实均为阳性克隆 ,即sIL_1R与pcDNA3 1(+)体外重组成功。结论 采用体外重组技术 ,成功地将人sIL_1RcDNA插入了真核表达载体pcDNA3 1(+)

蛛网膜下腔注射pcDNA3.1(+)-hPPE对大鼠神经病理性痛的镇痛效应

目的:观察蛛网膜下腔注射重组质粒pcDNA3.1(+)-hPPE对大鼠神经痛的镇痛作用。方法:SD大鼠随机分为坐骨神经慢性压迫(CCI)组、CCI假手术组、实验组和空质粒组。CCI组和CCI假手术组,用于观察疼痛持续时间;实验组和空质粒组分别于CCI术后第15天蛛网膜下腔注射重组质粒pcDNA3.1(+)-hPPE和空质粒pcDNA3.1(+)。测定各组注射质粒前后CCI模型鼠双后肢热痛阈(PWTL),观察纳洛酮对镇痛效应的影响,用放射免疫法检测脑脊液灌流液中脑啡肽(L-ENK)的含量,同时采用免疫组织化学方法测定两组大鼠脊髓背角N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体2B亚基(NR2B)表达的变化。结果:CCI术后7～33d,术侧PWTL明显低于对照侧。空质粒组注射前后热痛阈未见明显变化;与空质粒组相比,实验组大鼠蛛网膜下腔注射重组质粒pcDNA3.1(+)-hPPE后的第3天产生明显的抗伤害效应(PTWL升高),持续镇痛长达18d,且镇痛效应能被纳洛酮翻转。实验组脑脊液灌流液L-ENK含量显著高于空质粒组。与空质粒组比较,实验组大鼠脊髓背角NR2B阳性蛋白表达明显受到抑制。结论:蛛网膜下腔注射重组质粒pcDNA3.1(+)-hPPE能够减轻大鼠神经病理性疼痛的热痛敏行为。

生长抑素pcDNA3s/SS质粒的构建与鉴定

动物生长抑制激素 (Somatostatin ,SS)基因克隆至含有乙肝表面抗原的 pcDNA3s质粒载体上 ,生长抑素基因插入到乙肝表面抗原的 5′末端 ,构建生长抑素DNA疫苗 .经PCR反应扩增出含有SS和HBsAg的融合基因片段 ,并经测序证实SS基因已成功重组到

日本血吸虫真核表达质粒pcDNA3/HGPRT的构建及序列测定

目的应用基因工程技术,对日本血吸虫次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(hypoxanthine-guaninephosphoribosyltransferase,HGPRT)进行亚克隆,试图构建真核重组DNA质粒pcDNA3-HGPRT。方法通过筛选日本血吸虫成虫cDNA文库,克隆HGPRT基因片段,然后将目的片段亚克隆入真核表达载体pcDNA3。结果成功构建了真核重组DNA质粒pcDNA3-HGPRT,为进一步研究HGPRT的功能奠定了基础。

重组质粒pcDNA3-β-NGF的构建及其转染小鼠骨髓间充质干细胞生物学活性的研究

目的:构建人神经生长因子β亚基(β-NGF)真核表达载体,转染荧光小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)并研究其生物学活性。方法:全骨髓贴壁培养法分离、培养和纯化荧光小鼠MSCs,构建真核表达载体pcDNA3-β-NGF,并转染MSCs;免疫组织化学染色检测β-NGF的表达,观察β-NGF阳性的MSCs对小鼠海马神经元生长的作用。结果:荧光小鼠MSCs可发出明亮的绿色荧光,且荧光不随培养时间延长和传代次数增加而衰减。重组质粒pcDNA3-β-NGF转染MSCs后β-NGF阳性率为(37.12±2.14)%,高于MSCs组[(2.36±0.62)%]和空白对照组[(1.43±0.76)%],差异有统计学意义(P<0.05)。pcDNA3-β-NGF转染MSCs上清液培养的新生小鼠海马神经元的突起长度[(31±3)μm]较pcDNA3转染MSCs组[(23±4)μm]明显增加,差异有统计学意义(P<0.05),表明β-NGF基因转染MSCs培养上清液中的产物能促进小鼠海马神经元的突起生长,具有明显的生物学活性。结论:成功构建了pcDNA3-β-NGF真核表达载体,其转染的荧光小鼠MSCs能正确、稳定表达和分泌有生物学活性的β-NGF。

弓形虫和乙型肝炎病毒混合核酸疫苗的研究Ⅰ.pcDNA3-HBsAg-GRA1真核表达质粒的构建及鉴定

目的 构建 pcDNA3-HBsAg -GRA1真核表达质粒 ,为提高弓形虫DNA疫苗保护性做出新的探索 ,并期望“一 / +-苗两用”。方法 采用PCR分别扩增HBsAg、GRA1;经BclⅠ、EcoRⅠ双酶切HBsAg ;EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切GRA1;BamHⅠ、XhoⅠ双酶切载体 pcDNA3 0 ;HBsAg、GRA1、pcDNA3 0双酶切纯化产物与T4DNA连接酶在 2 2℃连接过夜 ,用双酶切及双脱氧末端终止法测序鉴定重组质粒。结果 成功构建pcDNA3-HBsAg -GRA1真核表达质粒。结论 为进一步研究 pcD NA3-HBsAg -GRA1诱导的保护性免疫奠定了基础。

重组质粒pcDNA3-gtfB在哺乳动物细胞中的表达

目的 :检测含有变形链球菌葡糖基转移酶抗原基因 (gtfB)的重组质粒pcDNA3_gtfB能否在哺乳动物细胞COS_1中正确地转录和表达。方法 :采用脂质体介导法 ,将pcDNA3_gtfB转染哺乳动物细胞COS_1,采用RT_PCR法、免疫组化LSAB法、Western免疫印迹法检测重组质粒的转录水平和表达产物。结果 :pcDNA3_gtfB在转染COS_1细胞后具有转录和翻译活性 ,蛋白质表达产物分子量为 116～ 2 12kD ,且可与兔抗葡糖基转移酶抗体发生特异性结合。结论 :重组质粒pcDNA3_gtfB在哺乳动物细胞中能正确地转录和表达 。

脂质体法pcDNA3-ELAC2质粒转染乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231以及前列腺癌细胞Du-145

目的:构建稳定、高效表达ELAC2基因的乳腺癌细胞模型MCF-7/ELAC2、MDA-MB-231/ELAC2,以及前列腺癌细胞模型Du-145/ELAC2,为探索ELAC2基因的生物学功能奠定实验基础。方法:将构建pcDNA3-ELAC2的质粒采用脂质体法转染乳腺癌细胞和前列腺癌细胞,用RT-PCR和WesternBlot分别检测ELAC2基因在细胞中的mRNA表达和蛋白表达。结果:pcDNA3-ELAC2质粒构建成功并顺利导入乳腺癌细胞和前列腺癌细胞中,且检测到ELAC2基因的mRNA和蛋白高表达。结论:构建的pcDNA3-ELAC2重组质粒能够在转染的乳腺癌细胞和前列腺癌细胞中稳定、持续和高效地表达,为进一步研究ELAC2基因的生物学功能提供了理想的实验模型。

重组质粒pcDNA3.1/SurP/Trail联合吉西他滨诱导胰腺癌细胞凋亡的实验研究

目的研究重组质粒pc DNA3.1/Sur P/Trail联合吉西他滨诱导胰腺癌细胞凋亡的能力。方法将人胰腺癌细胞株SW1990分为4组,第1组转染重组质粒联合吉西他滨(联合组),第2组单纯转染重组质粒(重组质粒组),第3组单纯加入吉西他滨(吉西他滨组),第4组未加任何处理(空白对照组)。通过Western blotting检测各组细胞中Trail蛋白表达的情况,并用流式细胞仪检测SW1990胰腺癌细胞凋亡率。结果 (1)重组质粒组、联合组均有Trail蛋白表达,吉西他滨组、空白对照组则无Trail蛋白表达;(2)联合组SW1990细胞凋亡率显著高于其他各组(P<0.05);重组质粒组和吉西他滨组SW1990细胞凋亡率显著高于空白对照组(P<0.05);重组质粒组与吉西他滨组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论重组质粒pc DNA3.1/Sur P/Trail与吉西他滨联可显著提高SW1990胰腺癌细胞的凋亡率。

脂质体介导下重组pcDNA3-hBMP3转染兔关节软骨细胞的条件

目的 探讨基因转移效率与 pc DNA3- h BMP3质粒及阳离子脂质体的浓度、转染时机以及细胞的种殖密度等因素的关系 ,以寻求最佳的基因转染条件 .方法 细胞密度按 2× 10 4· cm- 2 接种后 ,对细胞接种后即时、孵化 2 ,5和 7d进行转染效率研究 ;G418浓度每 m L DMEM分别含有 2 0 0 ,30 0 ,40 0 ,5 0 0和 6 0 0μg,探讨 G418对软骨细胞的杀伤作用 ;选择不同细胞接种密度、不同脂质体浓度和 pc DNA3- BMP3浓度 ,在细胞对数生长期且细胞融合至 70 %～ 80 %时开始做转染 ,各组软骨细胞爬片的原位杂交结果通过计算机图像分析 ,以其灰度值判定基因转染的效率 .结果 最佳期的转染时机为软骨细胞接种后在孵箱内放置 2 d转染 ,即在软骨细胞对数生长期内做转染 .G418对软骨细胞的最佳筛选浓度为 40 0 mg· L- 1 .最佳的细胞种植密度、pc DNA3- BMP3浓度和脂质体的量应分别为 2× 10 4· cm- 2 ,5 μL 和 10 μL.结论 通过本研究探索出脂质体介导下 pc DNA 3- BMP3转染兔关节软骨细胞的最佳条件 .

携带pcDNA3s与EGFPC3质粒的重组减毒沙门氏菌的免疫性与EGFP的表达

目的研究HBsAg DNA重组减毒鼠伤寒沙门氏菌的免疫性与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因EGFPC3在小鼠体内的表达。方法将质粒pcDNA3s与pEGFPC3分别电转化减毒鼠伤寒沙门氏菌SL8786,构建重组减毒鼠伤寒沙门氏菌SL8786/EGFPC3与SL8786/pcDNA3s。利用时间分辨荧光免疫分析技术(TRFIA)检测小鼠的血清抗体的含量,以及重组菌引起的T细胞增殖和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答。用荧光显微镜观察EGFPC3表达。结果口服SL8786/p cDNA3s免疫小鼠后,可诱导产生较强的特异性CTL应答。口服免疫小鼠后第11周抗-HBs含量最高。用流式细胞术检测贴壁培养的2只小鼠的脾细胞中SL8786/EGFPC3阳性率分别为19.20%和17.36%,而SL8786/pcDNA3口服的2只小鼠脾细胞中的EGFP阳性率分别仅为1.95%和1.63%。给小鼠口服SL8786/EGFPC33周后,在小鼠肝脏、脾脏、肾脏、胸腺、十二指肠及肌肉等组织中,均有EGFPC3的表达。结论口服SL8786/pcDNA3s在小鼠体内诱导了特异性细胞和体液免疫应答。携带EGFPC3的重组鼠伤寒沙门氏菌SL8786/EGFPC3在小鼠的部分组织中产生绿色荧光表达,该重组菌的构建为减毒沙门氏菌作为活载体基因工程疫苗的研制提供了一个优良模型。