人可溶性白介素-1受体真核表达载体pcDNA3/sIL-1R的构建

目的 本研究旨在构建人可溶性白介素_1受体 (sIL_1R)真核表达载体pcDNA3 sIL_1R ,为研究骨关节病的基因治疗奠定实验基础。方法 将人sIL_1R基因的RT_PCR纯化产物及质粒pcDNA3 1(+)DNA经KpnI和XhoI双酶切、胶回收纯化酶切片段后 ,体外连接酶切片段 ,使其定向重组 ,再将重组DNA转化E .coliCompetentCellsJM10 9,经复苏后 ,在含Ampr 的LB固体培养基上筛选出阳性克隆。结果 挑取的LB固体培养基上的 6个单菌落经酶切及测序鉴定 ,证实均为阳性克隆 ,即sIL_1R与pcDNA3 1(+)体外重组成功。结论 采用体外重组技术 ,成功地将人sIL_1RcDNA插入了真核表达载体pcDNA3 1(+)

分枝杆菌甾酮C_(1,2)位脱氢酶基因敲除的研究

利用分枝杆菌对植物甾醇进行边链降解可产生4-AD(4-烯-雄甾-3,17-二酮)和ADD(1,4-二烯-雄甾-3,17-二酮),ADD由4-AD在C1,2位脱氢酶(ksdD)作用下脱氢产生,这两种物质在化学结构上高度相似,难以分离。首先扩增出部分ksdD基因,大小为631bp,并以此为基础构建打靶载体pUC19-MK。将pUC19-MK电转分枝杆菌感受态,通过同源重组敲除分枝杆菌染色体上正常的ksdD基因,使C1,2位脱氢酶失活,以达到4-AD大量积累的目的。结果通过初筛筛选出5株转化子,进行甾体转化实验,发酵144h时,1号转化子的4-AD生成率达到17.52%,比出发菌株提高了192%,而此时ADD的生成率仅为6.12%,比出发菌株降低了89.9%。