pcDNA3.0-PTEN质粒转染15dPGJ2对乳腺癌MCF-7细胞体外培养的影响

目的：探讨15dPGJ2和PTEN质粒转染对人乳腺癌细胞株MCF-7体外培养的抑制作用，为临床靶向和基因治疗提供基础试验依据。方法：取生长良好的乳腺癌MCF-7细胞株，按5．0×10^6／L接种96孔板，按析因试验设置试验组，分别给予过氧化物酶体增殖物受体d然激动剂15dPGJ2，用野生型抑癌基因PTEN真核表达载体pcDNA3．0-PTEN质粒转染（脂质体转染法）MCF-7乳腺癌细胞株。采用MTT比色法观察15dPGJ2和野生型PTEN质粒转染对体外培养的MCF-7细胞系生长的抑制作用；用倒置光学显微镜观察MCF-7细胞用药前后的形态学变化；取生长良好对数生长期的MCF-7乳腺癌细胞株，调整细胞浓度至2．0×10^7／L接种于6孔板，设置3个复孔。连续培养3d；待细胞生长超过40％时，用15dPGJ240μmol／L，pcDNA3．0-PTEN质粒2μg／ml转染后连续培养3d常规消化收集细胞，离心，70％酒精固定，应用流式细胞仪检测凋亡细胞和细胞周期变化。结杲：15dPGJ2和PTEN质粒转染能有效的抑制体外培养的乳腺癌细胞株MCF-7的生长（P〈0．05），两者联合使用抑制效果更好（P〈0．05）。pcDNA3．0-PTEN质粒转染、15dPGJ240／μmol／L和两者联合干预在MCF-7乳腺癌细胞株连续72h时即达到有效抑制率，联合处理组处理MCF-7乳腺癌细胞株细胞生长抑制率最大（P〈0．05）。pcDNA3．0-PTEN质粒转染72h能将60．6％的MCF-7乳腺癌细胞阻滞在G0-1期（DNA合成前期）周期阻滞效果最为明显（P〈0．05）。与对照组相比pcDNA3．0-PTEN质粒转染、15d-PGJ2干预及联合用药均不能有效的诱导乳腺癌细胞MCF-7凋亡（P〈0．05））。联合用药细胞凋亡率低于单用15d-PGJ2（P〈0．05），pcDNA3．0-PTEN质粒转染可降低MCF-7乳腺癌细胞的凋亡率（P〈0．05）。结论：体外培养抑制试验证明pcDNA3．0-PTEN质粒转染、15dPGJ2 40μmol／L能有效的抑制乳腺癌细胞株MCF-7的生长，pcDNA3．0-PTEN质粒转染能抑制MCF-7乳腺癌细胞的恶性表型，pcDNA3．0-PTEN质粒转染抑制MCF-7乳腺癌生长的机制是周期阻滞，联合15d-PGJ2不增加周期阻滞作用。

尿路致病性大肠埃希菌Ⅰ型菌毛重组质粒pcDNA3.0-fimH的免疫保护作用

目的研究尿路致病性大肠埃希菌Ⅰ型菌毛重组质粒pcDNA3.0-fimH产生的免疫反应及其对小鼠的免疫保护作用。方法选取BALB/c小鼠60只,随机分为3组(PBS对照组、空质粒对照组、疫苗免疫组),3组分别用构建成功的重组质粒pcDNA3.0-fimH(为疫苗免疫组),载体质粒(pcDNA3.0)(为空质粒对照组)和PBS液(为PBS对照组),经股四头肌注射免疫小鼠,于第21天和第35天加强免疫。于免疫第0、14、28及42天收集小鼠膀胱冲洗液,检测各组SIgA水平。于免疫第42天采血,检测各组特异性IgG、IgG1、IgG2a水平。结果免疫后,疫苗免疫组小鼠膀胱灌洗液中sIgA水平随时间延长呈上升趋势,且明显高于PBS对照组及空质粒组(F=10.08,P<0.05);疫苗免疫组小鼠血清特异性IgG、IgG1、IgG2a抗体均明显高于对照组及空质粒组(P<0.05);结论 pcDNA3.0-fimH基因疫苗可诱导BALB/c小鼠产生特异性体液免疫,对小鼠尿道具有一定的免疫保护作用。

E.tenella河北株pcDNA3.0-IL-2-EtMIC-2真核表达载体的免疫调节作用

为了研究柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)河北株真核表达载体pcDNA3.0-IL-2-EtMIC-2的免疫调节作用,将240只14日龄雏鸡随机分成8组,第1,2组分别为阳性、阴性对照,在14,21 d,3、4组分别肌注100μg的pcDNA3.0-IL-2、pcDNA3.0-EtMIC-2;5、6、7组分别肌注50,100,150μg的pcDNA3.0-IL-2-EtMIC-2;8组21 d时滴口免疫鸡球虫病四价活疫苗。28 d,阳性对照组和6个试验组每只鸡经口攻毒4×10~4个E.tenella卵囊,阴性对照组每只鸡灌服同体积的生理盐水。结果显示:当pcDNA3.0-IL-2-EtMIC-2真核表达载体的免疫剂量达100,150μg/只时,试验后7,21,28 d IgG的含量、7 d的IgA含量和21,28 d的IFN-γ含量均显著高于阴性对照组、阳性对照组、单独免疫pcDNA3.0-IL-2和pcDNA3.0-EtMIC-2组(P<0.05);试验后28 d,血清中IL-2的含量显著高于阴性和阳性对照组(P<0.05),与单独免疫pcDNA3.0-IL-2和pcDNA3.0-EtMIC-2组相比差异不显著(P>0.05);试验后7,14,21,28 d脾脏IL-2和IFN-γmRNA表达量均显著高于阳性对照组、单独免疫pcDNA3.0-IL-2和pcDNA3.0-EtMIC-2组(P<0.05)。综上所述,IL-2可增强EtMIC-2基因的免疫原性,适量的真核表达载体pcDNA3.0-IL-2-EtMIC-2可显著提高感染柔嫩艾美尔球虫雏鸡的免疫功能。

TCF4／pcDNA3．0表达载体的构建及其在毛乳头细胞中的表达

目的构建TCF4/pcDNA3.0表达载体,为深入研究T细胞因子4(T cell factor4,TCF4)基因在毛乳头细胞生物学功能调控中的作用和机制奠定基础。方法从凝集性生长毛乳头细胞中提取总RNA,RT-PCR获得带有酶切位点的TCF4基因,亚克隆入pCDNA3.0载体中,并通过双酶切和测序确定序列和阅读框正确。稳定转染到毛乳头细胞中进行表达,检测稳定转染前后TCF4表达的变化。结果从人毛囊毛乳头细胞中获得TCF4基因克隆;成功构建了真核表达载体。经过稳定转染在毛乳头细胞中上调了TCF4基因mRNA和蛋白水平表达,促进了毛乳头细胞的增殖和外分泌功能。结论TCF4/pcDNA3.0表达载体能在真核细胞中表达。TCF4基因可以促进毛乳头细胞增殖。

野生型抑癌基因PTEN真核表达载体的鉴定及其在COS-7细胞株表达产物的鉴定

目的:电泳并真核细胞鉴定pcDNA3.0-PTEN真核表达质粒。方法:将含有pcDNA3.0-PTEN真核表达质粒的EcoliJM109细胞挑少许于LB液体培养基上,振荡过夜,离心,碱裂解法裂解细菌,参照UNIQ-10柱式质粒抽提试剂盒操作步骤抽提质粒,电泳鉴定,将获得的pcDNA3.0-PTEN真核表达质粒采用脂质体转染法转入COS-7细胞株,传代培养细胞株,West-Blot鉴定PTEN蛋白质的表达。结果:实验得到的pcDNA3.0-PTEN真核表达质粒大小约为6.0kb,质粒浓度为0.080μg/μl。该质粒目的基因在COS-7细胞株表达产物经West-Blot鉴定证实为目的基因表达产物。结论:pcDNA3.0-PTEN真核表达质粒内含有所需目的基因,该真核表达系统能在真核细胞株COS-7表达所需目的基因产物,可以应用该质粒对PTEN基因缺失或杂合性缺失的肿瘤细胞进行试验性治疗。

ATP7B基因治疗对Wilson病小鼠模型肝功能的影响

目的:探讨重组真核表达质粒pcDNA3.0/ATP7B基因治疗对TX小鼠肝功能的影响。方法:TX小鼠18只,随机分为6组,采用质粒和脂质体混合后进行尾静脉注射的方式,分别给予pcDNA3.0/APT7B 0、10、20、50、100、150μg,治疗3 d后测定其肝铜含量,确定最佳治疗剂量。然后选择36只TX小鼠,随机分为生理盐水(NS)组、pcDNA3.0组和pcDNA3.0/ATP7B组,分别以NS、PCDNA3.0、pcDNA3.0/ATP7B进行治疗,于治疗后第0、3、7、14天抽血检测ALT。结果:取100μg为治疗剂量;pcDNA3.0/APT7B组与NS组及pcDNA3.0组比较,于治疗后第3、7、14天ALT显著下降(P<0.05),以第3天下降最明显。结论:ATP7B基因重组真核表达质粒pcDNA3.0/ATP7B对TX小鼠肝功能有改善作用。

Gadd45a基因真核表达载体及其RNA干扰载体的构建

采用反转录PCR的方法,从人类肝组织细胞系L02中扩增Gadd45a基因的全长读码框,并将其克隆到pCDNA3.0上,该重组质粒命名为pC/Gadd45a。同时,采用化学方法合成Gadd45a基因的干扰序列,经退火后克隆至pCDNA3.0,命名为pC/shRNA。实验结果证实重组质粒pC/Gadd45a和pC/shRNA构建成功。然后,将pC/Gadd45a和pC/shRNA转染L02细胞后发现,Gadd45a基因在mRNA水平和蛋白水平上分别提高表达和降低表达。Gadd45a真核表达载体及其干扰载体的成功构建,为深入研究Gadd45a蛋白对肿瘤发生发展的作用以及该蛋白在细胞信号网络中的作用提供参考。

兔抗人重组生长激素rhGH多克隆抗体的制备、纯化及鉴定

目的制备抗人生长激素(growth hormone,GH)的多克隆抗体并鉴定其性能。方法真核细胞表达质粒pcDNA3.0-GHcDNA免疫家兔,制备rhGH多克隆抗体;ELISA法检测抗体效价。亲和层析法纯化后,进行Western blot、免疫组织化学和激光共聚焦显微镜检测,鉴定抗体的特异性与适用范围。结果得到兔抗人重组人生长激素rhGH多克隆抗体,效价达1:40000。纯化后的抗体可特异识别超表达的hGH和人内源性GH,可用于免疫组织化学实验、Western blot及激光共聚焦。结论用质粒免疫家兔制备的抗GH抗体具有较高的效价以及特异性,为hGH的功能性研究提供了有力的支持。

基因疫苗pcDNA-AChR_(α211)免疫小鼠建立重症肌无力动物模型

目的:用基因疫苗pcDNA-AChR_(α211)免疫C57BL/6小鼠建立实验性自身免疫性重症肌无力模型(EAMG)。方法:将人乙酰胆碱受体α亚基N端的主要免疫区(AChR_(α211))的基因片段插入到穿梭载体pcDNA3.0中,构建基因疫苗pcDNA-AChR_(α211)。大量提纯质粒pcDNA-AChR_(α211)后肌肉注射C57BL/6小鼠。用ELISA法检测小鼠血清中抗AChR_(α211)的IgG(ACh-RAb),并用PCR方法检测外源基因在小鼠各组织器官中的分布情况。结果:双酶切鉴定和序列测定表明构建了含正确目的基因阅读框的重组质粒pcDNA-AChR_(α211),ELISA分析表明该基因疫苗免疫的C57BL/6小鼠血清中含有AChRAb,且免疫三个月后在小鼠的肌肉、肝、脾、肾中仍可检测到目的基因AChR_(α211)的存在。结论:重组质粒pcDNA-AChR_(α211)作为基因疫苗能够诱导实验性自身免疫性重症肌无力。

hVEGF_(165)和嵌合水蛭肽融合基因的构建、表达和活性检测

根据抗PTCA或支架后再狭窄的基因治疗需要多基因治疗的特点,用基因重组技术构建了hVEGF165和嵌合水蛭肽(fusedhirudin,FH)融合基因,并克隆到真核表达载体pcDNA3.0中,通过脂质体介导将pcDNA3.0/hVEGF165-FH转染到人内皮细胞株(ECV304)中,RT-PCR及蛋白质印迹证明融合基因hVEGF165-FH在ECV304细胞中得到表达(分子质量为24ku左右).通过体外活性检测——MTT法检测hVEGF165-FH对ECV304细胞增殖的影响,通过体外血管生成分析hVEGF165-FH对内皮细胞株ECV304增殖的影响.通过体外抗栓活性检测,表明表达产物具有促进内皮细胞株增殖及加快血管生成的作用,同时显著抑制了ADP诱导的血小板聚集率(P<0.05)并显著延长APTT和TT(P<0.05).实验结果表明,融合基因在内皮细胞株中得到表达,表达的融合蛋白具有hVEGF165和嵌合水蛭肽(FH)的双重活性,这为以后的融合基因治疗再狭窄的动物实验打下了良好基础.

真核生物表达成熟体miR-449a及其生物学活性的研究

通过分子克隆技术将pre-miR-449a及其上下游200 bp序列克隆至pcDNA3.0多克隆位点,采用脂质体转染该载体至人宫颈癌Hela细胞中,Real-Time PCR检测载体的表达能力,同时使用荧光淬灭法检测表达产生的miRNA的生物学活性。结果表明:转染实验组载体的Hela细胞miR-449a的表达明显升高,而对照组表达几乎无变化,显示真核表达载体pcDNA3.0可以高效表达miRNA;此外,目的质粒与报告质粒共转染Hela细胞后绿色荧光明显淬灭而对照组荧光未淬灭,证明表达的miRNA具有生物学活性。

人线粒体超氧化物歧化酶真核表达载体的构建及其在HUVEC中的表达

目的:构建人线粒体超氧化物歧化酶2(SOD2)的真核细胞表达载体,探讨其在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中的表达效果。方法:以HUVEC mRNA为原始模板,应用RT-PCR技术,扩增编码线粒体SOD2全长的cDNA片段。利用分子生物学技术,将扩增的cDNA片段与真核细胞表达载体pcDNA3.0的多酶切位点相连接,构成重组质粒并转染到HUVEC,将细胞分为HUVEC母细胞组、转染pcDNA3.0空载组和转染pcDNA3.0-SOD2组。应用RT-PCR方法检测SOD2在HUVEC中的表达情况。结果:将表达SOD2全长cDNA片段定向克隆至质粒pcDNA3.0,测序结果表明成功构建人线粒体SOD2的真核细胞表达载体pcDNA3.0-SOD2。该载体稳定转染HUVEC后,在细胞内获得了稳定表达。与母细胞组和空载组比较,转染pcDNA3.0-SOD2组SOD2mRNA表达水平明显增加。结论:成功构建SOD2的真核细胞表达载体pcDNA3.0-SOD2,并在人HUVEC中成功表达。本研究为SOD2对细胞保护作用研究提供了实验模型。

小鼠IL-4真核表达载体的构建及表达

目的构建小鼠白介素-4(murine interleukin-4,mIL-4)的真核表达载体,并研究其在293T细胞中的表达。方法 RT-PCR扩增小鼠IL-4基因后,克隆到真核表达载体pcDNA3.0上,利用电泳和测序鉴定重组质粒的大小、序列。脂质体转染法将重组质粒pcDNA3.0-mIL-4转入293T细胞中,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测其表达。结果经酶切和测序鉴定重组质粒pcDNA3.0-mIL-4构建成功,并在293T细胞中成功表达。结论 pcDNA3.0-mIL-4可在真核细胞中成功表达,为进一步研究其在炎症性肠病(IBD)动物模型中的生物学功能提供了条件。

小鼠白介素-10真核表达载体的构建及表达

目的构建小鼠白介素-10(murineinterleukin-10,mIL-10)的真核表达载体,并研究其在293T细胞中的表达。方法 RT-PCR扩增小鼠脾脏IL-10基因后,克隆到真核表达载体pcDNA3.0上,酶切和测序鉴定重组质粒的大小、序列。采用脂质体转染法将重组质粒pcDNA3.0-mIL-10瞬时转染293T细胞,用Westernblot法检测IL-10表达。结果重组质粒pcDNA3.0-mIL-10构建成功,而且转染了293T细胞中提取的蛋白可检测到活性蛋白。结论经酶切和测序鉴定重组质粒pcDNA3.0-mIL-10构建成功,并在293T细胞中成功表达活性蛋白,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。

电脉冲刺激法提高小鼠miR-122表达的研究

目的:电脉冲能够改变细胞膜的通透性,促进外源DNA进入细胞内。通过基因导入仪电脉冲刺激已注入质粒pcDNA3.0-miR-122的小鼠肌肉细胞,检测对小鼠miR-122表达的影响。方法:将扩增得到的pre-miR-122克隆到真核表达载体pcDNA3.0上,构建pcDNA3.0-miR-122表达质粒。利用基因导入仪分别将生理盐水、pcDNA3.0、pcDNA3.0-miR-122质粒DNA导入小鼠腿部肌肉,然后进行电脉冲刺激。qRT-PCR测定各组小鼠血清及肝脏中的miR-122水平,同时检测肝癌组织和经Cecropin XJ处理的肝癌组织中的miR-122水平。结果:基因导入仪电脉冲刺激已注入pcDNA3.0-miR-122的腿部肌肉组织后,小鼠血清和肝脏中miR-122的表达分别提高了23和11倍,经Cecropin XJ处理的小鼠肝癌组织中miR-122的表达比对照高1.6倍。结论:电脉冲刺激能够显著提高小鼠体内miR-122的表达,为探讨miR-122表达对肝癌生长影响的调控作用奠定基础。

带Flag标签的Sirt4真核表达载体的构建及功能验证

目的构建带Flag标签pcDNA3.0载体的Sirt4真核表达载体,同时验证该基因与肝癌细胞HepG2生长之间的关系。方法以人卵巢文库为模板,采用PCR技术扩增出Sirt4的CDS区编码序列,将PCR产物插入到带Flag标签的pcDNA3.0载体上,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞提取质粒,测序正确后将pcDNA3.0-Flag和pcDNA3.0-Flag-Sirt4分别转染肝癌细胞HepG2,Western印迹实验鉴定目的基因蛋白表达,CCK-8法、克隆形成实验测定其对肝癌细胞HepG2生长的影响,Transwell证明Sirt4对肝癌细胞HepG2体外侵袭能力的影响。结果双酶切结果显示,pcDNA3.0-Flag-Sirt4真核表达载体构建成功;Western印迹实验验证该基因蛋白成功表达;CCK-8法和克隆形成实验证明过表达Sirt4基因抑制HepG2细胞增殖,Transwell证明过表达Sirt4明显抑制HepG2细胞体外侵袭能力。结论pcDNA3.0-Flag-Sirt4真核表达载体构建成功,过表达Sirt4基因可抑制肝癌细胞增殖及体外侵袭能力,为进一步研究Sirt4在肝癌中的发生与发展奠定了基础。