pcDNA3.1(+)/ATP7B对TX小鼠成纤维细胞铜代谢的影响

【目的】研究Wilson病野生型基因ATP7BcDNA真核表达载体pcDNA3.1(+)/ATP7B对TX小鼠成纤维细胞铜代谢的影响。【方法】构建人Wilson病野生型基因ATP7BcDNA的真核表达载体pcDNA3.1(+)/ATP7B。随机选取TX小鼠20只构建TX小鼠的成纤维细胞模型,平行分成3组,一组未加质粒,另两组分别加入等量pcDNA3.1(+)和pcDNA3.1(+)/ATP7B,观察对细胞模型铜代谢的影响。并进行免疫组化实验以观察表达是否增强。【结果】实验前未加质粒组,加入pcDNA3.1(+)组与加入pcDNA3.1(+)/ATP7B组细胞内铜含量分别为(78±20),(77±17),(75±13)ng/mg;实验后分别为(76±20),(74±13),(40±10)ng/mg。与未加质粒组和加入pcDNA3.1(+)相比,加入pcDNA3.1(+)/ATP7B组的细胞内铜含量显著下降(P皆<0.01),其细胞内ATP7B蛋白的表达明显增强。【结论】Wilson病真核表达载体pcDNA3.1(+)/ATP7B在TX小鼠成纤维细胞水平上确有排铜作用。

pcDNA3.1/mB7-H4-Fc在小鼠体内表达的实验性研究

目的获得重组pcDNA3.1/mB7-H4-Fc在肝内的高效稳定表达。方法采用流体动力法将表达mB7-H4-hIg融合蛋白的真核表达载体输注小鼠体内,通过酶联免疫吸附测定(ELISA)和实时定量PCR(RT-PCR)的方法,定量检测pcDNA3.1/mB7-H4-Fc在小鼠体的内表达。结果经尾静脉注射的pcDNA3.1/mB7-H4-Fc能在肝组织中稳定表达,在48h时间点分泌的量达到最高,最大量约120ng/mL。结论成功将pcDNA 3.1/mB7-H4-Fc表达载体导入了小鼠肝脏,并获得了pcDNA3.1/mB7-H4-Fc在肝内的高效稳定表达。

ATP7B基因治疗对Wilson病小鼠模型肝功能的影响

目的:探讨重组真核表达质粒pcDNA3.0/ATP7B基因治疗对TX小鼠肝功能的影响。方法:TX小鼠18只,随机分为6组,采用质粒和脂质体混合后进行尾静脉注射的方式,分别给予pcDNA3.0/APT7B 0、10、20、50、100、150μg,治疗3 d后测定其肝铜含量,确定最佳治疗剂量。然后选择36只TX小鼠,随机分为生理盐水(NS)组、pcDNA3.0组和pcDNA3.0/ATP7B组,分别以NS、PCDNA3.0、pcDNA3.0/ATP7B进行治疗,于治疗后第0、3、7、14天抽血检测ALT。结果:取100μg为治疗剂量;pcDNA3.0/APT7B组与NS组及pcDNA3.0组比较,于治疗后第3、7、14天ALT显著下降(P<0.05),以第3天下降最明显。结论:ATP7B基因重组真核表达质粒pcDNA3.0/ATP7B对TX小鼠肝功能有改善作用。

Wilson病ATP7B基因重组腺病毒载体Ad-ATP7B的构建

目的构建Wilson病基因ATP7B的重组腺病毒载体。方法分别以BamHⅠ+SalⅠ双酶切pcDNA3.0/ATP7B和pDC315,将ATP7BcDNA目的基因片段和线性化的pDC315连接,定向克隆构建pDC315/ATP7B,以PCR和酶切的方法鉴定。pDC315/ATP7B与腺病毒骨架共转染293细胞构建Ad-ATP7B,PCR进行鉴定。结果经PCR和酶切鉴定证实pDC315/ATP7B构建成功。pDC315/ATP7B与腺病毒骨架共转染293细胞后见明显的毒斑,说明二者在293细胞中同源重组并包装成功。经PCR证实重组腺病毒Ad-ATP7B构建已完成。结论本实验成功构建了ATP7B外源目的基因序列完全正确的重组腺病毒载体Ad-ATP7B,为下一步采用ATP7B基因重组腺病毒载体对Wilson病进行基因治疗打下了基础。