pcDNA 3.1-AKR1B10真核表达载体的构建

从胰腺癌PaTu8988S细胞中提取总RNA,并克隆AKR1B10基因,构建pcDNA 3.1-AKR1B10真核表达载体。转化感受态大肠杆菌DH5α细胞,提质粒,酶切及测序鉴定,pcDNA 3.1-AKR1B10真核表达载体构建成功。

人可溶性白介素-1受体真核表达载体pcDNA3/sIL-1R的构建

目的 本研究旨在构建人可溶性白介素_1受体 (sIL_1R)真核表达载体pcDNA3 sIL_1R ,为研究骨关节病的基因治疗奠定实验基础。方法 将人sIL_1R基因的RT_PCR纯化产物及质粒pcDNA3 1(+)DNA经KpnI和XhoI双酶切、胶回收纯化酶切片段后 ,体外连接酶切片段 ,使其定向重组 ,再将重组DNA转化E .coliCompetentCellsJM10 9,经复苏后 ,在含Ampr 的LB固体培养基上筛选出阳性克隆。结果 挑取的LB固体培养基上的 6个单菌落经酶切及测序鉴定 ,证实均为阳性克隆 ,即sIL_1R与pcDNA3 1(+)体外重组成功。结论 采用体外重组技术 ,成功地将人sIL_1RcDNA插入了真核表达载体pcDNA3 1(+)

HOGG1特异性锤头状核酶真核表达载体的构建及鉴定

目的 设计并合成人8 羟基鸟嘌呤 DNA糖苷酶(HOGG1)特异性的锤头状核酶(hammerheadribozyme)基因并构建其真核表达载体。鉴定含有核酶靶基因HOGG1cDNA保守序列的真核表达载体。方法 运用计算机软件人工设计并合成核酶基因(RZ) ,将核酶基因克隆到真核表达载体pcDNA 3 1中,重组子由BamHI和EcoRI酶切,琼脂糖凝胶电泳鉴定及DNA测序证实。含有HOGG1基因cDNA保守序列的真核表达载体经BamHI和EcoRI酶切电泳鉴定。结果 RZ人工合成后与pcDNA 3 1连接,酶切电泳及DNA测序证实合成的核酶基因序列正确并已被准确克隆入pcDNA 3 1的BamHI和EcoRI位点之间,命名为pcDNA 3 1 RZ。1 3kb的HOGG1基因cDNA保守序列准确克隆于pcDNA 3 1的BamHI和EcoRI酶切位点之间,命名为pcDNA 3 1 HOGG1。结论 成功合成HOGG1特异性的锤头状核酶基因并构建了该基因的真核表达载体,以及核酶靶基因的真核表达载体。

重组hPPAR-α受体表达质粒的构建

目的构建人PPAR-α受体的重组表达质粒。方法从基因库获取人PPAR-α基因蛋白编码区全长序列,依照引物设计原则及编码序列上已有酶切位点设计引物并添加酶切位点。从正常肝组织细胞提取总RNA,逆转录得cDNA,PCR扩增目的片段,克隆到pcDNA3.1真核表达载体,测序鉴定重组质粒目的基因蛋白编码区全长序列及开放阅读框的正确性,命名为pcDNA-hPPAR-α。结果核酸测序结果表明所得pcDNA-hPPAR-α的蛋白编码全长序列与基因库一致,正向插入载体pcDNA3.1多克隆位点NheⅠ和KpnⅠ之间,开放阅读框正确。结论成功构建重组质粒pcDNA-hPPAR-α。

人端粒酶催化亚单位(hTERT)特异性锤头状核酶真核表达载体的构建及鉴定

目的设计并合成人TERT特异性的锤头状核酶(hammerhead ribozyme)基因并构建其真核表达载体。含有核酶靶基因hTERTcDNA保守序列的T载体pMD18-T-hTERT的构建。方法运用计算机软件人工设计并合成核酶基因(RZ),将核酶基因克隆到真核表达载体pcDNA 3.1(+)中,重组子由BamH I和EcoR I酶切,琼脂糖凝胶电泳鉴定及DNA测序。RT-PCR法扩增目的基因cDNA保守序列,与pMD-18进行T-A连接,重组子经菌液PCR及测序鉴定。结果RZ人工合成后与pcDNA 3.1(+)连接,酶切电泳及DNA测序证实合成的核酶基因序列正确并已被准确克隆入pcDNA 3.1(+)的BamH I和EcoR I位点之间,命名为pcDNA 3.1-RZ。220bp的hTERT基因cDNA保守序列准确克隆于pMD18-T,命名为pMD18-T-hTERT。结论成功合成hTERT特异性的锤头状核酶基因并构建了该基因的真核表达载体,以及核酶靶基因的pMD18-T-hTERT载体。

人GRP78基因真核表达载体的构建及鉴定

目的利用PCR技术克隆人GRP78基因编码基因(约2000bp)。方法将PCR产物连接到pcDNA3.1(+)载体上,酶切鉴定后测序分析。结果序列分析表明,扩增片段与GenBank里登陆的序列同源性为100%。并以pcDNA3.1(+)表达载体为框架结构,尝试构建真核表达载体。结论测序分析结果表明序列同源性为100%。