pcDNA3.1-Egr.1p-p16基因联合放射治疗对裸鼠肿瘤的作用

目的:探讨pcDNA3.1 Egr.1p p16基因联合放射治疗移植人胰腺癌细胞JF 305裸鼠的抗肿瘤作用的 适宜照射剂量和质粒注入量。方法:不同剂量X射线照射(2,10,20Gy)及瘤内不同量脂质体包裹的pcDNA3.1 Egr.1p p16质粒(10,20,30μg)注入接种JF305胰腺癌细胞的裸鼠体内,测定各组裸鼠体积以观察各种处理抑瘤效 应的差异,并用RT PCR检测放射治疗后48h各组肿瘤局部p16mRNA水平。结果:质粒注入后接受20GyX射线 照射组照射后4～28d,肿瘤生长速率明显低于2Gy和10Gy照射组(P<0.05)。质粒注入量为20μg或30μg的 联合治疗组照射后4～28d,肿瘤生长速率明显低于注入量为10μg的联合治疗组(P<0.05)。单纯接种 pcDNA3.1 Egr.1p p16质粒组和接种pcDNA3.1 Egr.1p p16质粒照射组小鼠的肿瘤组织内有p16mRNA表达,且 pcDNA3.1 Egr.1p p16质粒照射组的p16mRNA水平明显高于单纯pcDNA3.1 Egr.1p p16质粒组(P<0.05)。结 论:pcDNA3.1 Egr.1p p16基因联合放射治疗小鼠体内抗肿瘤作用的适宜射线照射剂量为20Gy,质粒注入量为20 μg;pcDNA3.1 Egr.1p p16基因联合放射治疗的抗肿瘤作用明显优于单纯放射治疗或单纯基因治疗,这可能与辐射 激活Egr.1p基因后增强抑瘤基因p16的表达有关。

pcDNA3.1/hTSHR真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的 :构建pcDNA3.1(+)人促甲状腺激素受体 (hTSHR)基因真核表达载体 ,并在COS 7细胞中进行表达。方法 :以限制性内切酶EcoRI和XbaI双酶切pBluescriptSK(- ) /hTSHR ,获得hTSHRcDNA的全长片段 ,在以低熔点琼脂糖回收纯化后 ,定向插入真核表达载体pcDNA3.1(+)的多克隆酶切位点中 ,构建重组体pcDNA3.1/hTSHR ,进行酶切、PCR及测序鉴定。通过脂质体介导 ,转染COS 7细胞进行瞬时表达 ,并用RT PCR和免疫细胞化学染色法检测hTSHR的表达。结果 :双酶切pBluescriptSK(- ) /hTSHR得到约 2 70 0bp含TSHR全长cD NA的片段 ,同预期片段的大小相符。所构建的pcDNA3.1/hT SHR经双酶切及PCR鉴定同预期大小相符 ;测序结果与Gen Bank中收录的hTSHR全长序列一致 ,表明真核表达质粒构建正确。以脂质体转染COS 7细胞后 ,用RT PCR和免疫细胞化学染色法检测表明 ,细胞可表达hTSHR。结论 :成功地构建真核重组表达质粒pcDNA3.1/hTSHR ,为进一步研究TSHR的功能 ,以及利用hTSHR真核表达载体建立Graves实验动物模型奠定了基础。

pcDNA3.1（＋）-增强型绿色荧光蛋白在大鼠鞘内注射的表达

目的：构建重组质粒pcDNA3.1（＋）-增强型绿色荧光蛋白（EGFP）并观察其存大鼠体内的转染部位及表达时间。方法：构建重组质粒pcDNA3.1（＋）-增强型绿色荧光蛋白后直接注射到正常大鼠的蛛网膜下腔，观察其存大鼠体内转染后的时空效应。结果：双酶切结果符合真核表达载体pcDNA3.1（＋）约5.4kb，EGFP约750bp，另外测序分析与文献报道结果完全一致；动物实验结果表明，鞘内注射24h后存大鼠的脑脊膜和脊神经的外膜上有EGFP表达，在14d达到高峰，4周后明显下降，第7周消失；在实验组大鼠的心、肝、脾、肺、肾及股四头肌均没有绿色荧光。对照组所有取材部位均没有绿色荧光。结论：重组质粒pcDNA3.1（＋）-EGFP通过直接注射法被成功转染至大鼠的蛛网膜下腔，且外源基因得到了表达。

重组体pcDNA3.1(+)-tyr的构建及在小鼠NIH3T3细胞中的表达

[目的]克隆酪氨酸酶基因(tyr),构建pcDNA3.1(+)-tyr真核表达重组体,并导入NIH3T3细胞表达。[方法]用RT-PCR法从小鼠B16黑色素瘤细胞中克隆tyr全长cDNA片段,利用DNA重组技术将其定向插入真核表达质粒pcDNA3.1(+)的T7启动子下游,并用脂质体法导入NIH3T3细胞,RT-PCR,酪氨酸酶活性测定及多巴染色法检测tyr的表达。[结果]成功克隆1.74kb的全长tyr cDNA片段,经测序证实与GenBank所报道的序列完全一致,tyr准确克隆入pcDNA3.1(+)的多克隆位点,RT-PCR及酪氨酸酶活性测定等方法检测到转染了重组体的NIH3T3细胞中有tyr的表达。[结论]本实验成功构建了pcDNA3.1(+)-tyr真核表达重组体,并成功导入NIH3T3细胞中表达。

真核表达载体pcDNA3.1-MAGE-1的构建

目的:构建含MAGE-1基因的重组真核表达质粒。方法:用RT-PCR方法从人肝细胞肝癌组织中扩增出MAGE-1基因cDNA序列,克隆至pGEM-T载体,测序证实基因碱基序列无误后,再克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),构建了pcDNA3.1-MAGE-1重组质粒。结果与结论:RT-PCR获得长度为927bp的阳性产物,经T载体和pcDNA3.1(+)真核表达载体克隆、酶切鉴定及序列分析后,证实真核表达质粒pcDNA3.1-MAGE-1构建成功。

蛛网膜下腔注射pcDNA3.1(+)-hPPE对大鼠神经病理性痛的镇痛效应

目的:观察蛛网膜下腔注射重组质粒pcDNA3.1(+)-hPPE对大鼠神经痛的镇痛作用。方法:SD大鼠随机分为坐骨神经慢性压迫(CCI)组、CCI假手术组、实验组和空质粒组。CCI组和CCI假手术组,用于观察疼痛持续时间;实验组和空质粒组分别于CCI术后第15天蛛网膜下腔注射重组质粒pcDNA3.1(+)-hPPE和空质粒pcDNA3.1(+)。测定各组注射质粒前后CCI模型鼠双后肢热痛阈(PWTL),观察纳洛酮对镇痛效应的影响,用放射免疫法检测脑脊液灌流液中脑啡肽(L-ENK)的含量,同时采用免疫组织化学方法测定两组大鼠脊髓背角N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体2B亚基(NR2B)表达的变化。结果:CCI术后7～33d,术侧PWTL明显低于对照侧。空质粒组注射前后热痛阈未见明显变化;与空质粒组相比,实验组大鼠蛛网膜下腔注射重组质粒pcDNA3.1(+)-hPPE后的第3天产生明显的抗伤害效应(PTWL升高),持续镇痛长达18d,且镇痛效应能被纳洛酮翻转。实验组脑脊液灌流液L-ENK含量显著高于空质粒组。与空质粒组比较,实验组大鼠脊髓背角NR2B阳性蛋白表达明显受到抑制。结论:蛛网膜下腔注射重组质粒pcDNA3.1(+)-hPPE能够减轻大鼠神经病理性疼痛的热痛敏行为。

重组pcDNA3.1-hBMP-2转染人骨髓基质干细胞和对其增殖及血管内皮生长因子表达的影响

目的 构建人骨形成蛋白 - 2 (h BMP- 2 )真核表达载体 pc DNA3.1- h BMP- 2 ,转染人骨髓基质干细胞(MSCs) ,探讨基因转染对其增殖和血管内皮生长因子 (VEGF)表达的影响。 方法 利用重组 DNA和基因克隆技术构建重组载体 pc DNA3.1- h BMP- 2 ;细胞培养和基因转染技术体外转染人 MSCs;免疫细胞化学、原位杂交和蛋白印迹法检测细胞 BMP- 2的表达 ;通过流式细胞仪和 VEGF探针原位杂交分析其对细胞增殖和 VEGF表达的影响。 结果 转染后细胞在 m RNA水平和蛋白质水平均表达 BMP- 2 ;转染后 S期细胞比例增多 ,提示细胞 DNA的合成增加 ;BMP- 2基因转染上调细胞 VEGF的表达。 结论 在脂质体介导下 ,pc DNA3.1- h BMP- 2转染 MSCs获得成功。基因转染后能促进细胞增殖并将通过使 VEGF的表达增加促进血管再生 ,为进一步骨缺损的基因治疗及构建组织工程骨奠定了实验基础。

真核表达载体pcDNA3.1-myc-his(-)B的改构与应用

目的:对真核表达载体pcDNA3.1-myc-his(-)B进行改构,以简化目的基因克隆的步骤。方法:用事先设计好的2条寡核苷酸链互相退火,替换pcDNA3.1-myc-his(-)B的多克隆位点中NotⅠ与HindⅢ间的部分;利用改构的真核表达载体,分别构建亲环蛋白A、胆绿素还原酶B和过氧化氢酶基因的重组真核表达载体,瞬时转染293T细胞后,用His标签抗体验证其表达。结果:测序结果证实已将预想的序列替换至pcDNA3.1-myc-his(-)B的多克隆位点中相应位置,改构为质粒pcDNA3.1(-)reconstruct;利用改构的真核表达载体表达了相应的目的基因。结论:改构的真核表达载体pcDNA3.1(-)reconstruct可以简化融合myc和His标签的目的基因克隆的过程,并且增加了限制性位点的可选择性。

重组突变型DNA聚合酶β表达载体pcDNA3.1-polβ的构建

目的 :构建含突变型 polβ基因重组表达载体。 方法 :从食管癌标本中提取总RNA ,反转录合成cDNA ,克隆入 pCDNA3.1质粒。以通用鉴定引物PCR扩增、小量提取质粒酶切鉴定重组质粒 ,并进行测序。 结果 :测序结果证实重组载体中的外源片段序列与所选取的标本完全相符。结论 :成功构建了含突变型polβ基因重组表达载体 ,可应用于下游研究。

pcDNA3.1(+)-SAA真核表达载体构建、转染及其对人鼻咽癌细胞CNE-2增殖的影响

目的构建pcDNA3.1(+)-血清淀粉样蛋白A(SAA)真核表达载体,观察其在人鼻咽癌细胞CNE-2中的表达及对CNE-2增殖的影响。方法以CNE-2细胞的cDNA为模板,通过PCR扩增得到SAA片段,经酶切、纯化后与pcDNA3.1(+)连接;重组质粒经酶切分析及测序鉴定后,用脂质体转染法转染人鼻咽癌细胞CNE-2,用Western blot法检测转染前后该细胞中SAA蛋白的表达,并用MTT法检测转染重组质粒后的细胞增殖情况。结果 pcDNA3.1(+)-SAA经酶切、测序鉴定完全正确,真核表达载体构建成功;转染pcDNA3.1(+)-SAA真核表达载体后CNE-2细胞中SAA蛋白表达水平明显高增高;转染pcDNA3.1(+)-SAA后CNE-2细胞增殖速度加快。结论成功构建pcDNA3.1(+)-SAA真核表达载体,其能稳定表达于人鼻咽癌细胞CNE-2并促进细胞增殖;此为进一步研究SAA的生物学功能及鼻咽癌的新型治疗方法奠定了基础。

转化生长因子β2真核表达载体pcDNA3.1(+)/TGF-β2的构建及其在骨髓基质细胞的表达

目的 :构建人转化生长因子 β2的真核表达载体 pcDNA3.1(+) /TGF - β2 ,检测其转染骨髓基质细胞后的表达。方法 :用PCR方法从人胎盘cDNA文库DNA中扩增TGF - β2全长cDNA ,该基因片段两端设计了NheⅠ和XhoⅠ限制性酶切位点。将所得片段连接到T载体上测序证实。利用重组DNA技术将TGF - β2的cDNA构建到真核表达载体 pcDNA3.1(+)上 ,酶切鉴定。通过脂质体介导的转染技术 ,将所构建的载体导入从骨髓中分离培养的基质细胞中 ,体外单层培养。分别于转染后 2 4h和 4周利用RT -PCR和Western -Blotting方法检测目的基因的表达情况。结果 :经琼脂糖凝胶电泳及测序证实 ,PCR获得的片段与GenBank中登记的TGF - β2cDNA序列完全相同。pcDNA3.1(+) /TGF - β2酶切片段的长度与理论大小相符。转染后不同时期的骨髓基质细胞在mRNA和蛋白质水平均可检测到TGF - β2的表达。结论 :pcDNA3.1(+) /TGF - β2真核表达载体构建成功 。

猪囊尾蚴病重组DNA疫苗pcDNA3.1-TSO45-4B在小鼠体内的表达及诱导的细胞免疫效应

目的观察基于六钩蚴期的猪囊尾蚴病基因疫苗pcDNA3.1-TSO45-4B在小鼠体内的表达及诱导的小鼠细胞免疫应答。方法将真核重组表达质粒pcDNA3.1-TSO45-4B肌注小鼠,RT-PCR方法扩增出目的条带;ELISA方法检测小鼠血清细胞因子IL-2、IL-4及IFN-γ含量。结果RT-PCR产物为单一条带,大小为456bp,与TSO45-4B大小一致。免疫小鼠第2周细胞因子含量达到较高水平,第4周达到最高水平,第8周开始下降。结论基于猪囊尾蚴保护性抗原TSO45-4B的DNA疫苗能在小鼠体内表达并有效诱导细胞免疫效应。

pcDNA3.1-FKBP12.6基因表达载体的构建及扩增

目的构建并扩增pcDNA3.1-FKBP12.6基因表达载体。方法目的基因全基因合成,PCR加入酶切位点,连接入pGEM-Teasy载体,经酶切鉴定及测序后获得测序正确的目的基因。连接入真核表达载体pcDNA3.1(-),再经酶切鉴定及测序后进行pcDNA3.1-FKBP12.6的扩增。结果成功构建并扩增pcDNA3.1-FKBP12.6基因表达载体。结论pCDNA3.1-FK-BP12.6表达载体的构建,为深入研究FKBP12.6基因对心肌细胞结构和功能的影响奠定基础,进而为探索安全、高效的心肌功能异常的治疗提供新的途径。

pcDNA3.1(+)-MCP-1和pcDNA3.1(+)-Gro α真核表达质粒的构建及鉴定

目的:构建并鉴定真核表达质粒pcDNA3.1(+)-MCP-1和pcDNA3.1(+)-Groα. 方法:据GeneBank中大鼠MCP-1和GroαcDNA序列设计并合成引物,提取急性胰腺炎模型大鼠总RNA,RT-PCR 扩增,并将扩增产物TA克隆至pGEM-T easy载体,然后分别双酶切pGEM-MCP-1和pGEM-Groα回收目的片段再克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+). 结果:pcDNA3.1(+)-MCP-1和pcDNA3.1(+)-Gro α真核表达质粒构建完成后,用限制性内切酶、PCR及DNA序列分析等多种方法进行鉴定,证实其构建成功. 结论:pcDNA3.1(+)-MCP-1和pcDNA3.1(+)-Groα真核表达质粒构建成功,为进一步研究该真核表达质粒的免疫保护效果及制备急性胰腺炎pcDNA3.1(+)-MCP-1和pcDNA3.1(+)-GroαDNA疫苗奠定了基础.

pcDNA3.1^+-HIF-1α载体的构建和初步表达鉴定

目的克隆和构建带人低氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因真核表达载体pcDNA3.1+-HIF-1α。方法以大肠癌细胞株HT29的总RNA为模板,进行逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR),获得HIF-1α的cDNA,克隆入T载体,测序证实后克隆入真核表达载体pcDNA3.1+,酶切鉴定重组子。将构建好的pcDNA3.1+-HIF-1α用脂质体法转入HEK293细胞,RT-PCR鉴定重组质粒的表达。结果扩增出HIF-1αcDNA全长,测序结果与Genbank记载完全一致,成功克隆入真核表达载体pcDNA3.1+;建立了稳定的细胞株HEK293/pcDNA3.1+-HIF-1α。结论成功克隆和构建带人HIF-1α基因真核表达载体pcDNA3.1+-HIF-1α,并证明其能在真核细胞内表达。

气肿疽pcDNA3.1-CctA质粒在小鼠体内免疫应答的研究

为了检测pcDNA3. 1-CctA质粒的免疫效果,试验将pcDNA3. 1-CctA质粒转染至Vero细胞,48 h后提取细胞蛋白进行Western-blot检测,正确表达气肿疽梭菌细胞毒素A（CctA）基因后用质粒免疫动物,检测特异性抗体免疫球蛋白G2a（IgG2a）、免疫球蛋白G1（IgG1）、白细胞介素-4（IL-4）、γ干扰素（IFN-γ）的表达水平。结果表明：pcDNA3. 1-CctA质粒成功在Vero细胞中表达CctA蛋白;pcDNA3. 1-CctA质粒可有效刺激小鼠的体液免疫及细胞免疫应答,能在一定程度上提高机体的细胞免疫水平。

pcDNA3.1-BMP-2真核表达载体构建及转染兔骨髓基质细胞的实验研究

目的 构建人骨形态发生蛋白2(BMP-2)真核表达载体,鉴定并转染兔骨髓基质细胞,为转基因治疗骨缺失疾病提供实验基础。方法 双酶切克隆载体将BMP-2目的基因与真核表达载体pcDNA3.1连接,免疫组化及Western blotting检测转染BMP-2基因骨髓基质细胞的表达效果。结果 成功构建BMP-2真核表达载体,转染骨髓基质细胞后,有BMP-2表达。结论 骨髓基质细胞经基因转染后可以表达BMP-2,为进一步实验研究提供基础。

pcDNA3.1-Bcl-2真核表达载体构建

目的克隆大鼠Bcl-2基因(B cell lymphoma)全长cDNA,构建含大鼠Bcl-2基因的重组真核表达质粒。方法采用RT-PCR的方法从大鼠脾脏组织中扩增全长Bcl-2cDNA,将扩增产物克隆至pMD18-T载体,测序证实后,再克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),构建了pcDNA3.1-Bcl-2重组质粒。结果RT-PCR获得长度为720bp的阳性产物,经T载体和pcDNA3.1(+)真核表达载体克隆、酶切鉴定及序列分析后,证实真核表达质粒pcDNA3.1-Bcl-2构建成功。结论成功克隆了Bcl-2基因,并构建了pcDNA3.1-Bcl-2重组质粒,为进一步研究Bcl-2基因的功能及应用Bcl-2进行基因治疗奠定基础。

Notch1基因C端特征结构域pcDNA3.1-AN真核表达载体的构建

目的:扩增人胎盘组织Notch1基因C端特征性结构域ANK和NLS(简称AN),并构建pcDNA3.1-AN真核表达载体。方法:按照GenBank中Notch1序列,设计一对引物,利用RT-PCR方法从人胎盘组织中获取ANcDNA片段,将其克隆至真核表达质粒pcDNA3.1(+)中,构建重组真核表达载体pcDNA3.1-AN。结果:所获得的序列是Notch1特征性的AN结构域。结论:成功构建了pcDNA3.1-AN真核表达载体。

pcDNA3.1-mAFP真核表达载体的构建及其在293细胞中的表达

目的构建真核表达载体pcDNA3.1-mAFP,观察其在293肿瘤细胞中的表达情况。方法从Hepa1-6小鼠肝癌细胞中提取总RNA,设计特异性引物,通过RT-PCR法扩增小鼠甲胎蛋白(mAFP)基因编码区全长序列,测序确认后,插入到pcDNA3.1真核表达载体中,双酶切鉴定。用Lipofectamine脂质体将构建的重组载体转染293肿瘤细胞,检测AFP蛋白在293细胞中的表达情况。结果成功克隆了mAFP基因编码区全长序列,构建出重组真核表达载体pcDNA3.1-mAFP,脂质体转染后可检测到mAFP基因在293细胞中的表达。结论该研究成功构建了重组pcDNA3.1-mAFP真核表达载体,为进一步开展原发性肝癌的靶向性基因治疗奠定了基础。