木薯MeHsfB3b转录因子与MeFKBP20蛋白互作关系验证

热激转录因子MeHsfB3b是调控木薯抗细菌性枯萎病的重要节点,前期通过酵母双杂交技术获得MeHsfB3b的候选互作蛋白MeFKBP20,该蛋白属于FKBP型肽脯氨酰顺反异构酶基因家族。本研究克隆获得MeFKBP20基因全长为561 bp,编码186个氨基酸,蛋白质分子质量为19.99 kDa,具有FKPB_C结构域。表达模式分析发现:MeFKBP20基因在木薯成熟叶片及根部高表达,在幼叶和叶柄的表达量较低;并能够迅速响应病原菌XpmCHN11诱导,持续保持较高的表达丰度,推测其参与了木薯响应病原菌侵染的过程。利用酵母双杂交点对点、双分子荧光互补实验证明MeHsfB3b蛋白通过在201~241 aa区域与MeFKBP20蛋白作用。本研究结果有助于进一步解析MeHsfB3b基因调控木薯对细菌性枯萎病的抗病机理。

三氧化二砷通过降低Pin1表达及调节Wnt/β-连环素通路抑制肝癌细胞增殖

目的探讨三氧化二砷(ATO)在肝癌中对肽基脯氨酰基顺反异构酶NIMA相互作用蛋白1(Pin1)表达的抑制作用及其分子机制。方法使用DepMap数据库和GEPIA数据库中的数据分析Pin1在人肝癌细胞系和肝癌组织中的表达情况。以人肝癌细胞系Huh7和小鼠肝癌细胞系H22为细胞模型,通过ATP法检测ATO对肿瘤细胞活力的影响;通过蛋白质印迹法、免疫荧光染色和qPCR检测ATO对Pin1在蛋白质水平和转录水平表达的作用。用氯喹预处理Huh7细胞抑制溶酶体途径后,通过蛋白质印迹法和免疫荧光染色检测ATO对Pin1表达的调控作用。通过皮下荷瘤小鼠模型和免疫组织化学染色验证ATO在体内对肝癌细胞生长和Pin1表达的影响。采用RNA测序分析ATO可能影响的信号通路,并通过蛋白质印迹法和qPCR验证。结果在DepMap数据库23种人肝癌细胞系和GEPIA数据库人肝癌组织中,Pin1的表达均呈现较高水平。在体外实验中,ATO处理后Huh7和H22细胞的细胞活力均降低,细胞中Pin1在蛋白质和转录水平的表达均降低,但用氯喹抑制溶酶体途径逆转了ATO对Pin1表达的影响。在皮下荷瘤小鼠模型中,ATO表现出一定的抗肿瘤效果,免疫组织化学染色显示ATO处理后Pin1表达和肿瘤细胞增殖受到抑制。在ATO处理的H22细胞中Wnt/β-连环素通路相关基因富集,抑制H22细胞中Pin1的表达后β-连环素表达减少。结论ATO通过溶酶体途径抑制Pin1表达,以及影响Wnt/β-连环素信号通路来抑制肝癌细胞增殖。

肽基脯氨酰顺反异构酶1在肝癌中的研究进展

肽基脯氨酰顺反异构酶1(PIN1)在肝癌中异常表达,作为肿瘤催化分子在肝癌的增殖、侵袭、凋亡和血管生成等过程中发挥着重要作用。该文从PIN1的分子结构与功能、PIN1在肝癌中的表达及其在肝癌发生、发展中的作用等几方面进行综述。

肽基脯氨酰顺反异构酶抑制剂胡桃醌对宫颈鳞癌SiHa细胞凋亡的作用

目的:探讨肽基脯氨酰顺反异构酶抑制剂胡桃醌对宫颈鳞癌Si Ha细胞增殖和凋亡的影响及其促凋亡的机制。方法:选取处于对数生长期的Si Ha细胞,将其分为空白对照组和不同剂量(10、20、50、80及100μmol/L)胡桃醌给药组,共6组。采用MTT法观察胡桃醌对Si Ha细胞的抑制作用,并计算出半数抑制浓度(IC50=20.4μmol/L),依据IC50确定胡桃醌的有效浓度;选取与IC50接近的浓度(20μmol/L)通过Hoechst 33258及流式细胞术测定胡桃醌对Si Ha细胞凋亡的影响,Western blot检测凋亡相关蛋白caspase-3、8、9以及抑癌基因PTEN的蛋白水平。结果:MTT实验结果显示,与对照组比较,各给药组对细胞活力的抑制作用明显,差异有统计学意义(P<0.05);Hoechst 33258检测表明,20μmol/L胡桃醌处理细胞12 h后可出现明显的细胞核典型凋亡细胞形态,流式细胞术检测结果说明胡桃醌可诱导Si Ha细胞出现早期凋亡;Western blot检测显示与正常对照组相比,20μmol/L胡桃醌处理细胞12 h后,cleaved caspase-3、8、9及PTEN的蛋白水平明显增加。结论:胡桃醌可以抑制Si Ha细胞的活力,并诱导细胞凋亡,其机制主要是通过抑制caspase途径并增加抑癌基因的表达。

重组人亲环素A的表达、纯化及活性测定

将RT－PCR扩增得到的亲环素A（CyPA）基因片段插入原核表达载体pET11c中，得到重组质粒pET11／CyPA，转入大肠杆菌获得高效表达。Spe－PAGE分析表明，重组CyPA表达量占菌体可溶性蛋白的40％以上。经50％硫酸铵沉淀和DEAESepharoseCL－6B柱层析可纯化重组CyPA。用糜蛋白酶偶联法测定显示重组CyPA具有肽基脯氨酸顺／反异构酶活性。

亲环素A抑制剂研究进展

亲环素A是亲环素家族重要成员,是重要的免疫抑制药物环孢素A的体内结合蛋白,除了具有肽脯氨酰顺反异构酶活性,亲环素A在一系列生物途径中发挥作用,如蛋白折叠、装配、转运、神经生长调节和HIV病毒复制。总结了天然产物抑制剂、肽类抑制剂和有机合成分子等亲环素A抑制剂的发现和发展历程,对亲环素A抑制剂的研究进展进行了综述。

桑树绿枝扦插繁殖过程中ABI4和PIN1基因的表达变化及与生根性能的相关性

脱落酸非敏感型转录因子ABI4、生长素运输载体蛋白PIN1分别通过调控脱落酸和生长素的运输而影响植物不定根的发育与生长。以经生根粉诱导处理和未经诱导处理的桑树绿枝插穗为材料,用实时荧光定量PCR、Western blot技术检测插穗生根发育过程中基部皮层ABI4和PIN1基因的转录与蛋白质表达水平变化。当插穗出现不定根时,ABI4的转录与表达水平急剧下调,PIN1的转录水平急剧上调,而后在新生根伸长期二者均有所回复;生根剂诱导处理插穗后加大了其基部皮层ABI4的转录与表达下调幅度和PIN1的转录上调幅度,且PIN1在新生根伸长期持续高表达。ABI4的转录水平与不同桑品种生根率之间均呈显著的负相关关系(γ=-0.915),与生根数量没有相关性;而PIN1的转录水平与生根率和生根数量均呈显著的正相关关系(γ=0.880,γ=0.982)。农桑14号和强桑1号等是绿枝生根率高的桑品种,其插穗不定根出现时基部皮层ABI4的转录、表达下调幅度和PIN1的转录上调幅度大于大10等生根率低的桑品种,提示易生根品种的插穗在不定根出现时期ABI4的低水平和PIN1的高表达会更利于插穗根原基的形成、分化及新生根的生长。

益智健脑颗粒对快速老化小鼠SAMP8海马Pin1和HMGB1 mRNA表达的影响

目的:研究益智健脑颗粒对快速老化小鼠SAMP8海马肽基脯氨酰顺反异构酶(peptidylprolyl-cis-trans isomerase A,Pin1)和高迁移率族蛋白B1(high mobility group box1,HMGB1)mRNA表达的影响。方法:6月龄快速老化小鼠SAMP8随机分为中药治疗组和模型组,6月龄正常老化小鼠SAMR1为正常对照组。中药组以益智健脑颗粒浓缩液灌胃;正常对照组和模型组以双蒸水灌胃。8周后,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测海马组织中Pin1和HMGB1 mRNA的表达。结果:与模型组比较,中药治疗组Pin1 mRNA相对表达量上调(P<0.05);HMGB1mRNA相对表达量下调(P<0.05)。结论:益智健脑颗粒可能通过上调Pin1 mRNA表达,下调HMGB1 mRNA表达,来达到防治阿尔茨海默病的作用。

Pin1在宫颈癌中过表达及其与Ki67关系的研究

目的:探讨宫颈癌中肽基脯氨酰顺反异构酶Pin1表达、与Ki67的相关性及其临床意义。方法:应用RT-PCR和免疫组化技术检测宫颈癌组织中Pin1mRNA和蛋白表达水平及其与Ki67蛋白表达的相关性。结果:1)宫颈癌组织中Pin1mRNA表达明显高于正常宫颈组织(P<0.05);2)从正常宫颈到CIN再到浸润癌Pin1蛋白表达逐渐增强(P<0.05);3)Pin1蛋白过表达与临床分期、病理分级、淋巴结转移无明显相关(P>0.05);但宫颈腺癌Pin1表达明显高于宫颈鳞癌(P<0.05);4)Pin1过表达与Ki67表达呈显著正相关(P<0.05)。结论:1)Pin1过表达与宫颈癌细胞增殖有关,参与宫颈癌发生发展;2)Pin1过表达可作为宫颈癌诊断的辅助指标。

人FKBP12的基因克隆及其表达产物的生物活性

为获得具有生物学活性的 h FKBP1 2 ,筛选新型的促神经再生药物 .采用 RT- PCR、计算机辅助 p BV2 2 0中外源基因高效表达的数学模型预测方法及超滤截留纯化方法 ,从人 T淋巴白血病细胞系 Jurkat中成功扩增出 h FKBP1 2基因 .按照外源基因高效表达的数学模型 ,将其进行优化改构后 ,在 p BV2 2 0中实现了高效表达 ,表达量约 2 0 % .重组的包涵体蛋白经复性 ,纯化至电泳纯 ,纯化后的 h FKBP1 2显示出肽基脯氨基顺反异构酶活性 .表明原核表达的 h FKBP1

Pinl抑制剂Juglone对食管癌EC1细胞增殖的抑制作用

目的:测定Pinl抑制剂(Juglone)对食管癌细胞EC1生长增殖的影响,探讨Juglone的抗肿瘤作用.方法:体外培养人食管癌细胞系EC1,用MTT试验观察细胞生长增殖状况,流式细胞仪检测细胞周期以及细胞凋亡.结果:MTT试验表明,Juglone对EC1细胞生长有明显的抑制作用,且抑制作用随作用浓度和作用时间增加而增强.流式细胞仪检测表明,加入Juglone培养48h后,EC1细胞出现G2期阻滞.Juglone药物(10、20、30μmol/L)培养48h后,EC1细胞的凋亡率明显增加,与对照组相比有统计学意义(9.06%,32.88%,53.18%vs8.77%,均P<0.05).结论:Pinl抑制剂Juglone可以通过抑制Pinl表达从而抑制食管癌细胞的增殖,Pinl抑制剂有望成为新型的抗肿瘤治疗靶点.

大肠杆菌肽基脯氨酰顺反异构酶slyD基因缺失株的构建及生物学特性研究

肽基脯氨酰顺反异构酶(PPIases)广泛存在于原核生物中,主要生物功能是专一性催化已磷酸化的丝/苏-脯氨酞顺/反异构。为研究大肠杆菌PPIases sly D基因缺失对其生物学特性的影响,本研究利用改进的Red重组方法构建大肠杆菌BL21株的sly D缺失株,命名为BL21Δsly D;并通过突变株的形态学变化、生长特性、生化代谢特性、耐酸性、耐渗透压能力、耐温度缺氧能力对其进行鉴定。结果表明,缺失株生长速率、耐高温缺氧能力与亲本株相比差异不显著,然而突变株的耐酸性与耐渗透压能力则显著低于亲本株(p<0.01),表明大肠杆菌PPIases sly D基因可能影响双组份调控系统的调节作用。本研究构建的大肠杆菌sly D基因缺失株BL21Δsly D为进一步研究大肠杆菌sly D基因的功能奠定了基础。

人亲环素B基因的克隆表达及重组蛋白的生物活性

应用ＲＴ－ＰＣＲ方法从人淋巴细胞中扩增出亲环素Ｂ（ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎＢ，ＣｙＰＢ）基因，克隆入ｐＥＴ－２８ａ载体中表达．表达产物以包涵体形式存在，占细菌可溶性蛋白的１５％．经Ｎｉ－ＮＴＡ树脂金属螯合亲和层析和ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－５０柱层析纯化，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测呈单一条带，毛细管电泳为单一色谱峰，纯度达９５％．经复性处理。

西罗莫司产生菌——吸水链霉菌的FK506结合蛋白

目的 分离吸水链霉菌菌体蛋白质 ,探讨西罗莫司产生菌—吸水链霉菌的 FK5 0 6结合蛋白 (FKBPs)。方法 制备西罗莫司产生菌—吸水链霉菌菌体蛋白 ,分离蛋白质并进行 PPIase酶活性测定。 结果 获得吸水链霉菌的蛋白谱型 ,其中 2 5 k D蛋白质及 15 .5 k D蛋白质具有 PPIase活性 ,初步认定相当于 FKBP2 5及 FKBP12。 结论 西罗莫司产生菌—吸水链霉菌中存在二种 FKBPs,即 FKBP2 5和 FKBP12 ,与前人报告不合。

人FKBP52的基因克隆、表达及活性研究

为获得具有生物学活性的hFKBP5 2 ,来筛选新型的促神经再生药物 .采用半巢式、桥联PCR及亲和层析方法 ,从人胎脑cDNA文库中成功扩增出hFKBP5 2基因 ,在 pET2 8a (+ )中实现了高效、可溶性的融合表达 ,表达量约 30 % .重组的蛋白质经亲和纯化至电泳纯 ,纯化后的hFKBP5 2显示出肽基脯氨基顺反异构酶活性 .表明原核表达的hFKBP5 2具有类似于其天然蛋白质的生物学活性 .

肽基脯氨酰顺反异构酶1和细胞周期蛋白D1在食管鳞状细胞癌中的表达

目的研究肽基脯氨酰顺反异构酶1(Pin1)和细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)在食管鳞状细胞癌中的表达及意义。方法通过免疫组织化学SP法检测37例食管鳞状细胞癌标本癌组织及癌旁组织中Pin1与Cyclin D1蛋白的表达,分析各临床病理参数对食管鳞状细胞癌组织中Pin1及Cyclin D1表达的影响。结果 Pin1在癌旁正常组织中不表达或呈微弱的核表达,在癌组织中呈阳性表达;Cyclin D1在癌旁正常组织中不表达,在癌细胞的细胞质或细胞核内呈阳性或强阳性表达。有淋巴结转移者Pin1表达较未转移者高,差异有统计学意义(P<0.05),分化程度、年龄、性别及TNM分期等临床病理参数对Pin1的表达无影响(P>0.05)。分化程度高者Cyclin D1表达较低,分化程度低者Cyclin D1表达较高,差异有统计学意义(P<0.05),年龄、性别及肿瘤分期等临床病理参数对Cyclin D1的表达无明显影响(P>0.05)。结论 Pin1和Cyclin D1在食管鳞状细胞癌中的表达明显增高,二者相互作用调节细胞周期,促进食管鳞状细胞癌的发生。

PPIB蛋白对结肠癌成瘤的影响和低氧机制

目的:研究肽酰脯氨基顺反异构酶B(peptidyl-prolyl cis-trans isomerase,PPIB)蛋白对结肠癌细胞成瘤的影响,探讨结肠癌低氧发病的机制。方法:应用RNAi技术,构建下调PPIB蛋白表达的稳转结肠癌细胞株,移植到BALB/c裸鼠皮下,检测PPIB蛋白下调组与对照组的成瘤差异。TUNEL法检测两组移植瘤的细胞凋亡水平。低氧培养结肠癌细胞株,Western印迹法检测PPIB的表达水平与低氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)的关系。结果:下调PPIB蛋白表达后,在裸鼠皮下成瘤的能力显著减弱。SW480-si PPIB下调组的移植瘤体积显著小于SW480-NC对照组(P<0.01)。TUNEL检测显示下调组的癌细胞凋亡比例显著高于对照组(P<0.001)。在低氧环境下培养后,结肠癌细胞的PPIB蛋白表达水平随着低氧条件下HIF-1α的上调而升高(P<0.05)。结论:PPIB蛋白在结肠癌中因为低氧环境而表达升高,且在升高后通过抑制癌细胞的凋亡而发挥促进结肠癌形成和进展的作用,是一个极具临床应用价值的防治结肠癌的分子靶点。

Pin1在乳房外Paget病的表达及意义

目的:分析Pin1染色后乳房外Paget病组和对照组切片中Pin 1的表达及意义。方法:采用免疫组化染色的方法,对27例乳房外Paget病和10例正常皮肤标本进行Pin1免疫组化染色,并将乳房外Paget病组按照浸润深度分成三组分别观察。结果:乳房外Paget病组阳性率74.07%,其中51.85%为高表达,对照组阳性率30%,均为低表达,差异具有统计学意义(P<0.05)。乳房外Paget病标本按照浸润深度分成三组进行比较,差异来自对照组与乳房外Paget病各组之间,在乳房外Paget病组内部进行两两比较无统计学意义。结论:Pin1在正常皮肤组织中不表达或极低表达,在乳房外Paget病患者皮损中的表达增高。

紫花苜蓿肽基脯氨酰顺反异构酶基因全长cDNA的电子克隆及同源建模

[目的]研究对紫花苜蓿肽基脯氨酰顺反异构酶基因全长cDNA进行电子克隆及同源建模的方法。[方法]根据物种间同源基因相对保守的特点,利用NCBI数据库,对公共EST数据库进行同源检索筛选和重叠群装配,获得拼接cDNA序列,经过ORFFinder分析后获得相应蛋白质的全长序列,并利用Swiss-Mode服务器预测各原子坐标,进而利用Swiss-PdbViewer生成三维空间模型。[结果]采用该方法成功获得紫花苜蓿肽基脯氨酰顺反异构酶基因的完整cDNA序列,全长为1880bp,mPPI蛋白质编码68AA,分子量约为7829.9Da,理论等电点pI=8.99,原子组成为C338H547N103O103S4,摩尔消光系数280nm处为4595,不稳定系数为42.16,脂肪系数为83.24,总平均亲水性为-0.456。[结论]根据物种间同源基因序列对跨物种间EST数据库进行同源检索筛选和拼接,是基因克隆的一条有效途径。

Pin1抑制剂Juglone对宫颈癌细胞增殖的抑制作用

目的比较Pin1抑制剂(Juglone)和环磷酰胺(CTX)对4株宫颈癌细胞生长的影响,以探讨Juglone的抗肿瘤作用。方法体外培养人宫颈癌细胞系HeLa、SiHa、C33a以及Caski,用细胞生长曲线和MTT试验观察细胞生长状况,流式细胞仪检测细胞周期,Western blot和比色法检测Caspase3蛋白表达及活性。结果细胞生长曲线和MTT试验均表明,Juglone对4株宫颈癌细胞生长有明显的抑制作用,且抑制作用随作用浓度和作用时间增加而增强。流式细胞仪检测表明,Juglone(50μmol/L)培养24h后,G2/M期细胞比例数较CTX组明显增加,而G0/G1期细胞比例数却较CTX组降低。Western blot和比色法显示Juglone各浓度组中Caspase3活性明显高于CTX组。结论Juglone可能通过体外抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡等途径抑制肿瘤的发展。