木薯MeHsfB3b转录因子与MeFKBP20蛋白互作关系验证

热激转录因子MeHsfB3b是调控木薯抗细菌性枯萎病的重要节点,前期通过酵母双杂交技术获得MeHsfB3b的候选互作蛋白MeFKBP20,该蛋白属于FKBP型肽脯氨酰顺反异构酶基因家族。本研究克隆获得MeFKBP20基因全长为561 bp,编码186个氨基酸,蛋白质分子质量为19.99 kDa,具有FKPB_C结构域。表达模式分析发现:MeFKBP20基因在木薯成熟叶片及根部高表达,在幼叶和叶柄的表达量较低;并能够迅速响应病原菌XpmCHN11诱导,持续保持较高的表达丰度,推测其参与了木薯响应病原菌侵染的过程。利用酵母双杂交点对点、双分子荧光互补实验证明MeHsfB3b蛋白通过在201~241 aa区域与MeFKBP20蛋白作用。本研究结果有助于进一步解析MeHsfB3b基因调控木薯对细菌性枯萎病的抗病机理。

三氧化二砷通过降低Pin1表达及调节Wnt/β-连环素通路抑制肝癌细胞增殖

目的探讨三氧化二砷(ATO)在肝癌中对肽基脯氨酰基顺反异构酶NIMA相互作用蛋白1(Pin1)表达的抑制作用及其分子机制。方法使用DepMap数据库和GEPIA数据库中的数据分析Pin1在人肝癌细胞系和肝癌组织中的表达情况。以人肝癌细胞系Huh7和小鼠肝癌细胞系H22为细胞模型,通过ATP法检测ATO对肿瘤细胞活力的影响;通过蛋白质印迹法、免疫荧光染色和qPCR检测ATO对Pin1在蛋白质水平和转录水平表达的作用。用氯喹预处理Huh7细胞抑制溶酶体途径后,通过蛋白质印迹法和免疫荧光染色检测ATO对Pin1表达的调控作用。通过皮下荷瘤小鼠模型和免疫组织化学染色验证ATO在体内对肝癌细胞生长和Pin1表达的影响。采用RNA测序分析ATO可能影响的信号通路,并通过蛋白质印迹法和qPCR验证。结果在DepMap数据库23种人肝癌细胞系和GEPIA数据库人肝癌组织中,Pin1的表达均呈现较高水平。在体外实验中,ATO处理后Huh7和H22细胞的细胞活力均降低,细胞中Pin1在蛋白质和转录水平的表达均降低,但用氯喹抑制溶酶体途径逆转了ATO对Pin1表达的影响。在皮下荷瘤小鼠模型中,ATO表现出一定的抗肿瘤效果,免疫组织化学染色显示ATO处理后Pin1表达和肿瘤细胞增殖受到抑制。在ATO处理的H22细胞中Wnt/β-连环素通路相关基因富集,抑制H22细胞中Pin1的表达后β-连环素表达减少。结论ATO通过溶酶体途径抑制Pin1表达,以及影响Wnt/β-连环素信号通路来抑制肝癌细胞增殖。

肽基脯氨酰顺反异构酶1在肝癌中的研究进展

肽基脯氨酰顺反异构酶1(PIN1)在肝癌中异常表达,作为肿瘤催化分子在肝癌的增殖、侵袭、凋亡和血管生成等过程中发挥着重要作用。该文从PIN1的分子结构与功能、PIN1在肝癌中的表达及其在肝癌发生、发展中的作用等几方面进行综述。

Pin1在神经退行性疾病中的分子机制

Pin1(peptidylprolyl cis/trans isomerase NIMA-interacting 1)为脯氨酸肽酶异构酶的亚类,是一种催化蛋白质中磷酸化丝氨酸(苏氨酸)―脯氨酸基序之间的肽键异构化酶,具有调节蛋白质折叠、细胞内信号转导、转录、细胞凋亡等功能。Pin1在中枢和周围神经系统中广泛表达,可调节各种神经元发育、凋亡和突触活动。尽管有研究报道,Pin1与神经元底物相互作用影响特定的信号通路,但在神经元水平的生物学功能仍缺乏更全面的了解。此外,越来越多的证据表明,Pin1在衰老及与年龄相关的神经退行性疾病(包括阿尔茨海默病、帕金森病、额颞痴呆、亨廷顿病和肌萎缩侧索硬化)中发挥着至关重要的作用,在这些疾病中,其介导了从神经保护到神经毒性的截然不同的作用。因此,进一步研究Pin1在神经元中的生物学功能,明确Pin1在年龄相关和神经退行性疾病中的分子机制,可为临床治疗相关疾病提供分子靶点。

肽基脯氨酰顺反异构酶抑制剂胡桃醌对宫颈鳞癌SiHa细胞凋亡的作用

目的:探讨肽基脯氨酰顺反异构酶抑制剂胡桃醌对宫颈鳞癌Si Ha细胞增殖和凋亡的影响及其促凋亡的机制。方法:选取处于对数生长期的Si Ha细胞,将其分为空白对照组和不同剂量(10、20、50、80及100μmol/L)胡桃醌给药组,共6组。采用MTT法观察胡桃醌对Si Ha细胞的抑制作用,并计算出半数抑制浓度(IC50=20.4μmol/L),依据IC50确定胡桃醌的有效浓度;选取与IC50接近的浓度(20μmol/L)通过Hoechst 33258及流式细胞术测定胡桃醌对Si Ha细胞凋亡的影响,Western blot检测凋亡相关蛋白caspase-3、8、9以及抑癌基因PTEN的蛋白水平。结果:MTT实验结果显示,与对照组比较,各给药组对细胞活力的抑制作用明显,差异有统计学意义(P<0.05);Hoechst 33258检测表明,20μmol/L胡桃醌处理细胞12 h后可出现明显的细胞核典型凋亡细胞形态,流式细胞术检测结果说明胡桃醌可诱导Si Ha细胞出现早期凋亡;Western blot检测显示与正常对照组相比,20μmol/L胡桃醌处理细胞12 h后,cleaved caspase-3、8、9及PTEN的蛋白水平明显增加。结论:胡桃醌可以抑制Si Ha细胞的活力,并诱导细胞凋亡,其机制主要是通过抑制caspase途径并增加抑癌基因的表达。

重组人亲环素A的表达、纯化及活性测定

将RT－PCR扩增得到的亲环素A（CyPA）基因片段插入原核表达载体pET11c中，得到重组质粒pET11／CyPA，转入大肠杆菌获得高效表达。Spe－PAGE分析表明，重组CyPA表达量占菌体可溶性蛋白的40％以上。经50％硫酸铵沉淀和DEAESepharoseCL－6B柱层析可纯化重组CyPA。用糜蛋白酶偶联法测定显示重组CyPA具有肽基脯氨酸顺／反异构酶活性。

亲环素A抑制剂研究进展

亲环素A是亲环素家族重要成员,是重要的免疫抑制药物环孢素A的体内结合蛋白,除了具有肽脯氨酰顺反异构酶活性,亲环素A在一系列生物途径中发挥作用,如蛋白折叠、装配、转运、神经生长调节和HIV病毒复制。总结了天然产物抑制剂、肽类抑制剂和有机合成分子等亲环素A抑制剂的发现和发展历程,对亲环素A抑制剂的研究进展进行了综述。

脊椎动物Cyclophilin A肽基脯氨酰顺反异构酶活性及遗传变异分析

Cyclophilin A(简称CypA)由PPIA(Peptidylprolyl isomerase A)基因编码,是典型的Cyclophilin家族蛋白,具有肽基脯氨酰顺反异构酶活性,在蛋白质的折叠和转运、信号转导、炎症、免疫调节、细胞凋亡及病毒复制等生物学过程中发挥着重要作用。本研究重点探讨了不同脊椎动物CypA的肽基脯氨酰顺反异构酶活性及其遗传变异。根据Gen Bank数据库PPIA基因的序列信息,克隆了脊椎动物的PPIA基因并构建其原核表达载体,其中鼠耳蝠(Myotis davidi)和绿头鸭(Anas platyrhynchos)的PPIA基因序列为首次报道。利用大肠杆菌表达GST-Cyp A融合蛋白并进行亲和层析,切除GST标签后再进行分子筛层析,获得纯化的CypA蛋白。利用胰糜蛋白酶偶联法测定CypA的肽基脯氨酰顺反异构酶活性,发现12种脊椎动物CypA的肽基脯氨酰顺反异构酶活性无显著差异。同时,通过一系列遗传变异和分子进化分析,发现12种脊椎动物CypA的酶活位点、CsA结合位点等重要功能域的氨基酸序列完全一致,而且其结构和在染色体中的基因定位也非常保守。研究结果表明,脊椎动物CypA的关键功能域高度保守,这是CypA维持其酶活及生物学功能的有力保障。

桑树绿枝扦插繁殖过程中ABI4和PIN1基因的表达变化及与生根性能的相关性

脱落酸非敏感型转录因子ABI4、生长素运输载体蛋白PIN1分别通过调控脱落酸和生长素的运输而影响植物不定根的发育与生长。以经生根粉诱导处理和未经诱导处理的桑树绿枝插穗为材料,用实时荧光定量PCR、Western blot技术检测插穗生根发育过程中基部皮层ABI4和PIN1基因的转录与蛋白质表达水平变化。当插穗出现不定根时,ABI4的转录与表达水平急剧下调,PIN1的转录水平急剧上调,而后在新生根伸长期二者均有所回复;生根剂诱导处理插穗后加大了其基部皮层ABI4的转录与表达下调幅度和PIN1的转录上调幅度,且PIN1在新生根伸长期持续高表达。ABI4的转录水平与不同桑品种生根率之间均呈显著的负相关关系(γ=-0.915),与生根数量没有相关性;而PIN1的转录水平与生根率和生根数量均呈显著的正相关关系(γ=0.880,γ=0.982)。农桑14号和强桑1号等是绿枝生根率高的桑品种,其插穗不定根出现时基部皮层ABI4的转录、表达下调幅度和PIN1的转录上调幅度大于大10等生根率低的桑品种,提示易生根品种的插穗在不定根出现时期ABI4的低水平和PIN1的高表达会更利于插穗根原基的形成、分化及新生根的生长。

益智健脑颗粒对快速老化小鼠SAMP8海马Pin1和HMGB1 mRNA表达的影响

目的:研究益智健脑颗粒对快速老化小鼠SAMP8海马肽基脯氨酰顺反异构酶(peptidylprolyl-cis-trans isomerase A,Pin1)和高迁移率族蛋白B1(high mobility group box1,HMGB1)mRNA表达的影响。方法:6月龄快速老化小鼠SAMP8随机分为中药治疗组和模型组,6月龄正常老化小鼠SAMR1为正常对照组。中药组以益智健脑颗粒浓缩液灌胃;正常对照组和模型组以双蒸水灌胃。8周后,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测海马组织中Pin1和HMGB1 mRNA的表达。结果:与模型组比较,中药治疗组Pin1 mRNA相对表达量上调(P<0.05);HMGB1mRNA相对表达量下调(P<0.05)。结论:益智健脑颗粒可能通过上调Pin1 mRNA表达,下调HMGB1 mRNA表达,来达到防治阿尔茨海默病的作用。

人FKBP12的基因克隆及其表达产物的生物活性

为获得具有生物学活性的 h FKBP1 2 ,筛选新型的促神经再生药物 .采用 RT- PCR、计算机辅助 p BV2 2 0中外源基因高效表达的数学模型预测方法及超滤截留纯化方法 ,从人 T淋巴白血病细胞系 Jurkat中成功扩增出 h FKBP1 2基因 .按照外源基因高效表达的数学模型 ,将其进行优化改构后 ,在 p BV2 2 0中实现了高效表达 ,表达量约 2 0 % .重组的包涵体蛋白经复性 ,纯化至电泳纯 ,纯化后的 h FKBP1 2显示出肽基脯氨基顺反异构酶活性 .表明原核表达的 h FKBP1

Pinl抑制剂Juglone对食管癌EC1细胞增殖的抑制作用

目的:测定Pinl抑制剂(Juglone)对食管癌细胞EC1生长增殖的影响,探讨Juglone的抗肿瘤作用.方法:体外培养人食管癌细胞系EC1,用MTT试验观察细胞生长增殖状况,流式细胞仪检测细胞周期以及细胞凋亡.结果:MTT试验表明,Juglone对EC1细胞生长有明显的抑制作用,且抑制作用随作用浓度和作用时间增加而增强.流式细胞仪检测表明,加入Juglone培养48h后,EC1细胞出现G2期阻滞.Juglone药物(10、20、30μmol/L)培养48h后,EC1细胞的凋亡率明显增加,与对照组相比有统计学意义(9.06%,32.88%,53.18%vs8.77%,均P<0.05).结论:Pinl抑制剂Juglone可以通过抑制Pinl表达从而抑制食管癌细胞的增殖,Pinl抑制剂有望成为新型的抗肿瘤治疗靶点.

人亲环素B基因的克隆表达及重组蛋白的生物活性

应用ＲＴ－ＰＣＲ方法从人淋巴细胞中扩增出亲环素Ｂ（ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎＢ，ＣｙＰＢ）基因，克隆入ｐＥＴ－２８ａ载体中表达．表达产物以包涵体形式存在，占细菌可溶性蛋白的１５％．经Ｎｉ－ＮＴＡ树脂金属螯合亲和层析和ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－５０柱层析纯化，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测呈单一条带，毛细管电泳为单一色谱峰，纯度达９５％．经复性处理。

大肠杆菌肽基脯氨酰顺反异构酶slyD基因缺失株的构建及生物学特性研究

肽基脯氨酰顺反异构酶(PPIases)广泛存在于原核生物中,主要生物功能是专一性催化已磷酸化的丝/苏-脯氨酞顺/反异构。为研究大肠杆菌PPIases sly D基因缺失对其生物学特性的影响,本研究利用改进的Red重组方法构建大肠杆菌BL21株的sly D缺失株,命名为BL21Δsly D;并通过突变株的形态学变化、生长特性、生化代谢特性、耐酸性、耐渗透压能力、耐温度缺氧能力对其进行鉴定。结果表明,缺失株生长速率、耐高温缺氧能力与亲本株相比差异不显著,然而突变株的耐酸性与耐渗透压能力则显著低于亲本株(p<0.01),表明大肠杆菌PPIases sly D基因可能影响双组份调控系统的调节作用。本研究构建的大肠杆菌sly D基因缺失株BL21Δsly D为进一步研究大肠杆菌sly D基因的功能奠定了基础。

西罗莫司产生菌——吸水链霉菌的FK506结合蛋白

目的 分离吸水链霉菌菌体蛋白质 ,探讨西罗莫司产生菌—吸水链霉菌的 FK5 0 6结合蛋白 (FKBPs)。方法 制备西罗莫司产生菌—吸水链霉菌菌体蛋白 ,分离蛋白质并进行 PPIase酶活性测定。 结果 获得吸水链霉菌的蛋白谱型 ,其中 2 5 k D蛋白质及 15 .5 k D蛋白质具有 PPIase活性 ,初步认定相当于 FKBP2 5及 FKBP12。 结论 西罗莫司产生菌—吸水链霉菌中存在二种 FKBPs,即 FKBP2 5和 FKBP12 ,与前人报告不合。

大肠杆菌二硫键异构酶DsbA和脯氨酸异构酶PPIaseA双顺反子表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

用ＰＣＲ方法获得大肠杆菌二硫键异构酶ＤｓｂＡ的编码基因ｄｓｂＡ和大肠杆菌脯氨酸异构酶ＰＰＩａｓｅＡ的编码基因ｒｏｔ，并将ＤｓｂＡ和ｒｏｔ以双顺反子形式克隆至含有Ｐｔａｃ启动子的表达载体ｐＫＫ２３３－２中。在ＩＰＴＧ的诱导下，ＤｓｂＡ和ＰＰＩａｓｅＡ获得了表达。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和薄层扫描分析表明：ＤｓｂＡ、ＰＰＩａｓｅＡ的表达水平分别为占菌体裂解上清液总蛋白质的４．３２％和４．０６％。

人FKBP52的基因克隆、表达及活性研究

为获得具有生物学活性的hFKBP5 2 ,来筛选新型的促神经再生药物 .采用半巢式、桥联PCR及亲和层析方法 ,从人胎脑cDNA文库中成功扩增出hFKBP5 2基因 ,在 pET2 8a (+ )中实现了高效、可溶性的融合表达 ,表达量约 30 % .重组的蛋白质经亲和纯化至电泳纯 ,纯化后的hFKBP5 2显示出肽基脯氨基顺反异构酶活性 .表明原核表达的hFKBP5 2具有类似于其天然蛋白质的生物学活性 .

稳定干扰Pin1基因的食管癌细胞株的筛选及其生物学特征

目的:筛选稳定干扰Pin1的食管癌细胞系,研究Pin1表达与食管癌细胞生物学特征的关系.方法:将针对Pin1基因的shRNA(pmU6-Pin1)转染入EC1细胞,经G418加压筛选稳定表达Pin1小干扰RNA的细胞株,用免疫印迹法检测细胞中Pin1的表达,确定筛选细胞系的正确性.通过MTT实验以及流式细胞仪检测Pin1抑制对食管癌细胞增殖、凋亡的影响.结果:Western blot检测结果显示,Pin1蛋白表达被成功抑制,建立了稳定表达Pin1小干扰RNA的细胞株(shPin1).与正常EC1细胞比较,MTT实验和流式细胞术实验结果表明基因沉默Pin1抑制食管癌细胞增殖(抑制率为51.8%),诱导细胞凋亡(凋亡率为46.39%);并增加了食管癌细胞EC1对顺铂的敏感性,抑制食管癌细胞增殖以及诱导细胞凋亡的能力均有所增强,抑制率从23.5%上升到61.0%,凋亡率从26.10%上升到58.95%.结论:稳定干扰Pin1食管癌细胞系的建立为进一步研究Pin1在食管癌中的作用提供了研究平台;基因沉默Pin1增加了食管癌细胞对顺铂的敏感性.

肽基脯氨酰顺反异构酶1和细胞周期蛋白D1在食管鳞状细胞癌中的表达

目的研究肽基脯氨酰顺反异构酶1(Pin1)和细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)在食管鳞状细胞癌中的表达及意义。方法通过免疫组织化学SP法检测37例食管鳞状细胞癌标本癌组织及癌旁组织中Pin1与Cyclin D1蛋白的表达,分析各临床病理参数对食管鳞状细胞癌组织中Pin1及Cyclin D1表达的影响。结果 Pin1在癌旁正常组织中不表达或呈微弱的核表达,在癌组织中呈阳性表达;Cyclin D1在癌旁正常组织中不表达,在癌细胞的细胞质或细胞核内呈阳性或强阳性表达。有淋巴结转移者Pin1表达较未转移者高,差异有统计学意义(P<0.05),分化程度、年龄、性别及TNM分期等临床病理参数对Pin1的表达无影响(P>0.05)。分化程度高者Cyclin D1表达较低,分化程度低者Cyclin D1表达较高,差异有统计学意义(P<0.05),年龄、性别及肿瘤分期等临床病理参数对Cyclin D1的表达无明显影响(P>0.05)。结论 Pin1和Cyclin D1在食管鳞状细胞癌中的表达明显增高,二者相互作用调节细胞周期,促进食管鳞状细胞癌的发生。

人肽基脯氨酰顺反异构酶基因的克隆、表达、纯化及热变性交联

蛋白质分子间交联是普遍存在的现象 .然而 ,蛋白质交联的分子机理还不太清楚 .为了进一步探测蛋白质交联的分子机理 ,以及交联能否在异源肽链间发生 ,本实验室克隆了人肽基脯氨酰顺反异构酶 (humanPeptidylproly cis trans isomerase ,hPPI)cyclophilincDNA基因 ,并纯化出了PPI蛋白 .最后 ,将PPI和lysozyme蛋白进行热变性交联实验 ,结果显示在同源和异源肽链间都有二聚体和多聚体形成 .并证实蛋白质交联可经三步完成 :1 )蛋白质构象包括二级结构改变 ;2 )形成分子间二硫键 ;3)