高产苯乳酸菌株选育及发酵豆粕工艺优化

该研究以泡菜为原料,以金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)与大肠杆菌(Escherichia coli)为指示菌,通过溶钙圈法及牛津杯法初筛,苯乳酸产量检测复筛,从泡菜中分离筛选具有抑菌性能的高产苯乳酸菌株,将其应用于发酵豆粕以评估其产苯乳酸性能,并对其进行形态学观察、生理生化实验及分子生物学鉴定。结果表明,共获得8株具有抑菌效果的菌株,其中,菌株R69苯乳酸产量最高,为1.25 mg/mL,添加苯丙酮酸时,该菌株固态发酵豆粕的苯乳酸产量为425.70 mg/kg,该菌株被鉴定为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。菌株R69固态发酵豆粕时,添加0.2%蛋白酶、3%糖蜜和0.15%苯丙酮酸可提高苯乳酸含量,苯乳酸含量达到624.49 mg/kg,且可有效抑制大肠杆菌和霉菌的生长。

苯乳酸的微生物合成及分离研究进展

苯乳酸是一种高值有机酸和新型的天然防腐剂,可由乳酸菌等多种微生物代谢产生。苯乳酸有着较为宽广的抑菌谱,对大多数革兰氏阳性、阴性菌和真菌都有明显的抑菌作用,不仅作为天然抑菌剂可替代化学合成的防腐剂,而且可经聚合反应合成聚苯乳酸新型高分子材料,作为聚乳酸高分子的替代物。因此,苯乳酸在化工、制药、生物、材料和食品等领域有广阔的应用前景。本文从苯乳酸抑菌特性、微生物菌株、转化合成、代谢途径及下游分离纯化等方面,简述了其生物转化合成和分离的研究现状。微生物菌株是苯乳酸合成的关键,基因工程菌的转化能力虽然高效,但构建工程菌较复杂;从自然环境中筛选安全优良的菌株,可以简化转化合成过程,提高转化率和料液中苯乳酸的浓度;苯乳酸的分离纯化还处于实验室的规模,有待进一步探索以达到工业化的要求。

一株高产苯乳酸菌株的安全性评价与发酵工艺优化

该研究利用传统生物发酵技术生产苯乳酸,并对高产苯乳酸菌株种属、安全性以及发酵工艺进行研究。通过反相高效液相色谱法筛选得到1株高产苯乳酸菌株BLCC2-0069,该菌株发酵24 h后发酵液中苯乳酸的含量为1.26 g/L;借助菌株形态观察和16S rDNA序列鉴定,初步确定该菌株为植物乳杆菌(Lactobacillu plantarum);该菌株培养4 h进入对数生长期,10 h进入稳定期,活菌数可达到1.78×10^(9) cfu/mL。通过对该菌株的小鼠体内安全评价,初步确定该菌株的体内安全性。同时还对植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)BLCC2-0069的发酵工艺进行研究,发现在培养基中添加3.00 g/L苯丙酮酸为底物时发酵液中苯乳酸产量最高可达3.96 g/L。综上,植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)BLCC2-0069对小鼠无毒,具有较高生物安全性,直接发酵苯乳酸的产量可达到1.26 g/L,添加底物发酵苯乳酸产量可达到3.96 g/L。研究结果可为菌株的安全应用提供理论基础。

苯基乳酸耐受性大肠杆菌的筛选及其高产苯基乳酸特性

苯基乳酸(phenyllactic acid,PLA)耐受性菌株的筛选能够有效降低PLA对生产菌株的抑制作用,有利于PLA产量的提高。通过紫外诱变的方法筛选耐受PLA的菌株,并应用于PLA的合成。以Escherichia coli BL21(DE3)作为原始出发菌株,通过紫外诱变的方法诱变筛选获得一株耐受PLA突变菌株E.coli Z2016(CCTCC保藏编号M2016332)。以E.coli Z2016为宿主菌,分别构建了重组菌株E.coli Z2016 pET-28a-ldh^(Y52V)和E.coli Z2016 pET-28a-ldhL用于D-和L-苯基乳酸的合成。结果表明:E.coli Z2016在含有1 g/L D-PLA的培养基中能够正常生长;重组突变菌株E.coli Z2016 pET-28a-ldh^(Y52V)和E.coli Z2016 pET-28a-ldhL全细胞合成D-PLA和L-PLA产量分别为6.75、6.97 g/(L·h),较重组出发菌株分别提高了14.02%和8.95%;分批补加底物反应120 min,E.coli Z2016 pET-28aldh^(Y52V)得到的D-PLA为20.02 g/L,较对照组提高22.17%,转化率为90.07%;E.coli Z2016 pET-28a-ldhL得到的L-PLA产量为20.87 g/L,较对照组提高16.85%,最终转化率为91.24%。筛选耐受性菌株是提高PLA产量的有效途径。

高产D-苯乳酸菌株的选育及发酵工艺的试验研究

试验利用高效液相法(HPLC)从发酵制品中筛选高产D-苯乳酸的LB2366,对其进行系统发育分析、菌落形态观察及生理生化试验研究,确定菌株LB2366为短乳杆菌。试验通过正交试验研究菌株LB2366产D-苯乳酸的发酵条件,确定4个因素的主次关系为:葡萄糖浓度>酵母粉浓度>苯丙氨酸浓度>培养时间。最佳反应条件为葡萄糖15 g/L、酵母粉5 g/L、苯丙氨酸浓度20 g/L、培养时间72 h。经过发酵培养,得到最高D-苯乳酸产量为194.27 mg/L。研究表明,优化后的D-苯乳酸产量比优化前的76.16 mg/L提高1.55倍。

亚硝基胍法诱变选育高产苯乳酸菌株

以自主分离的植物乳杆菌LY-78为出发菌株,通过亚硝基胍法诱变,以抑菌效价为检测指标,采用双层平板拮抗法和牛津杯琼脂扩散法筛选突变菌株。对筛选的突变菌株进行发酵试验,采用反相高效液相色谱法定量检测苯乳酸含量,然后根据产苯乳酸含量的多少,确定最佳菌株。试验结果表明,亚硝基胍诱变质量浓度为1.0 mg/mL、诱变时间为40 min时所获得的突变菌株NY-34具有较高的苯乳酸产量,即648 mg/L,比诱变前(246 mg/L)提高2.63倍。