Förster resonance energy transfer reveals phillygenin and swertiamarin concurrently target AKT on different binding domains to increase the anti-inflammatory effect

The clinical benefit of combination therapy is significant,but it is not easy to define the mechanism of complexity and diversity.Previous studies illustrate that phillygenin(Phi)binds in the allosteric inhibit pocket of protein kinase B(AKT),and swertiamarin(Swe)acts on the pleckstrin homology(PH)domain of AKT.However,the combined synergistic effect of relieving the inflammatory response has yet to be elucidated.Based on high sensitivity,specificity and fast-responsibility fluorescent sensors,the Förster resonance energy transfer(FRET)technique offers a route to provide clear insights into physiological and pathological processes.In the study,molecular docking,the fluorescent probes of Phi and Swe for FRET were designed and synthesized.FRET analysis shown that Swe and Phi concurrently acted on the PH domain and allosterically inhibited pocket of AKT,respectively.The combination of Swe and Phi significantly increased the heat stability of AKT and decreased protease-induced degeneration.In lipopolysaccharides(LPS)-induced mice and cells,the combination arrested AKT activation,nuclear factor kappa-B(NF-κB)phosphorylation,and the expression of tumor necrosis factor-α(TNF-α),interleukin(IL)-6 and IL-8.In conclusion,FRET revealed Phi and Swe concurrently targeted AKT on different domains and the combination of Phi and Swe enhanced the anti-inflammatory effect.

连翘脂素调节JAK2/STAT3信号通路对前列腺癌增殖、凋亡和上皮间质转化的影响

目的探讨连翘脂素(PHI)对前列腺癌(PCa)增殖、凋亡和上皮间质转化的影响及其机制。方法体外培养DU-145和LNCap-FGC细胞,将细胞分为对照组(Control组)、连翘脂素组(PHI组)、Janus激酶2(JAK2)抑制剂组(Ag490组)、连翘脂素+激活剂组(PHI+Colivelin组),分别检测细胞活力、细胞克隆能力、划痕愈合率及细胞侵袭;免疫组化法分析E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)表达;Westernblot检测JAK2、p-JAK2、信号转导和转录激活因子3(STAT3)、p-STAT3蛋白表达。结果与Control组比较,PHI组与Ag490组DU-145和LNCap-FGC胞存活率、细胞克隆数、划痕愈合率、细胞侵袭数、N-cadherin、Vimentin及p-JAK2、p-STAT3表达显著降低,细胞凋亡率和E-cadherin表达显著升高(P<0.05);PHI组与Ag490组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。与PHI组比较,PHI+Colivelin组细胞存活率、细胞克隆数、细胞划痕愈合、细胞侵袭数、N-cadherin、Vimentin及p-JAK2、p-STAT3表达显著增加,细胞凋亡率和E-cadherin显著降低(P<0.05)。结论PHI可抑制JAK2/STAT3信号通路抑制PCa细胞增殖并诱导细胞凋亡,逆转DU-145和LNCap-FGC上皮间质转化进程。

连翘脂素调节Ras/Raf/MEK/ERK信号通路对结直肠癌细胞恶性生物学行为的影响

目的 探究连翘脂素(PG)对结直肠癌细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡以及上皮间质转化的影响及机制。方法 培养HCT116结直肠癌细胞,采用10~200μmol/L的连翘脂素处理细胞,检测细胞存活率,筛选最佳实验浓度。将细胞分为对照组(Control组),连翘脂素低、中、高浓度组(PG-L组、PG-M组、PG-H组),连翘脂素高浓度+转染慢病毒阴性对照组(PG-H+NC组),连翘脂素高浓度+Ras慢病毒组(PG-H+Ras组)。平板克隆形成实验检测细胞增殖;划痕实验检测细胞迁移;Transwell小室法检测细胞侵袭;流式细胞术以及Hoechst33258染色法检测细胞凋亡;Western blot法检测上皮间质转化(EMT)标志蛋白E型钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)以及信号通路相关蛋白p-Raf、p-MEK、p-ERK表达;建立荷瘤小鼠模型评价连翘脂素对结直肠癌肿瘤生长的影响。结果 10~200μmol/L的连翘脂素处理HCT116结直肠癌细胞,可以显著抑制细胞存活率,经计算IC50值为(140.4±2.147)μmol/L,选择10、50、100μmol/L连翘脂素进行后续实验;与Control组比较,PG-L组、PG-M组、PG-H组HCT116细胞克隆形成率、划痕愈合率、细胞侵袭个数以及Vimentin、p-Raf、p-MEK、p-ERK表达显著降低,细胞凋亡率以及E-cadherin表达显著升高,且呈浓度依赖性(P<0.05);与PG-H+NC组比较,PG-H+Ras组HCT116细胞克隆形成率、划痕愈合率、细胞侵袭个数以及Vimentin、p-Raf、p-MEK、p-ERK表达显著升高,细胞凋亡率以及E-cadherin表达显著降低(P<0.05);连翘脂素可以显著抑制结直肠癌移植瘤的生长。结论 连翘脂素可以抑制结直肠癌细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡以及上皮间质转化,其作用机制可能与抑制Ras/Raf/MEK/ERK信号通路激活有关。

光枝勾儿茶化学成分研究(Ⅱ)

目的研究光枝勾儿茶全株的化学成分．方法采用硅胶柱色谱，Sephadex LH-20凝胶柱色谱进行分离，通过波谱学方法鉴定化合物结构。结果分离得到7个化合物，分别鉴定为5，7-二羟基-2-甲基色原酮（Ⅰ）；5，7-二羟基-2-甲基色原酮-7-O-β-D-葡萄糖苷（Ⅱ）；大黄素（Ⅲ）；大黄素-3-O-α-L-鼠李糖苷（Ⅳ）；连翘脂素（Ⅴ）；槲皮素（Ⅵ）和芦丁（Ⅶ）。结论化合物Ⅰ～Ⅴ均为首次从该属植物中分得。

微生物转化连翘苷制备连翘脂素的研究

本文旨在开发一种微生物转化工艺,将连翘苷转化为活性更高的连翘脂素。结果从土壤中分离筛选到一株桔青霉(Penicillium citrinum)LB菌株,转化连翘苷为连翘脂素的专一性较高。经培养基主要组成和转化条件优化,得出较佳的产酶培养组成为:蔗糖7g/L,(NH_4)_2SO_4 5g/L,NaCl 5g/L,KH_2PO_4 5g/L,MgSO_4 1g/L,MnSO_4 0.5g/L,pH6.0。LB菌株经产酶培养后,过滤收集菌体悬浮于2倍发酵液体积的磷酸盐缓冲液中,加入2g/L的底物连翘苷,于30℃、200r/min转化20h,连翘脂素的转化得率可达94.1%。利用微生物将连翘苷转化为连翘脂素,具有方法简单、转化得率高、产物容易纯化和副产物少等优点,有潜在的工业化应用价值。

HPLC同时测定连翘药材中5种特征性成分

目的：建立连翘药材中连翘新苷A、连翘酯苷A、松脂醇β-D葡萄糖苷、连翘苷和连翘脂素的含量测定方法。方法：采用高效液相色谱-二极管阵列检测法（HPLC-DAD）,采用Welch Ultimate C18（4.6mm×250mm,5μm）色谱柱,流动相为水（A）-乙腈（B）,梯度洗脱,流速1m L/min,柱温25℃。结果：连翘新苷A、连翘酯苷A、松脂醇β-D葡萄糖苷、连翘苷、连翘脂素进样浓度分别在7.81~500.00μg/m L,2.42~620.00μg/m L,1.21~620.00μg/m L,2.27~580.00μg/m L,0.59~600.00μg/m L之间有良好的线性关系。平均回收率分别为99.93%、99.95%、99.65%、99.52%、99.74%,RSD分别为2.09%、1.93%、1.17%、1.76%、0.88%。结论：该方法稳定性好,精密度高,重复性好,对于连翘药材的质量控制提供了理论依据。

连翘绿茶和连翘红茶的特征成分测定及营养成分比较

建立了同时测定连翘叶茶中连翘酯苷A、连翘苷、芦丁和连翘脂素的液相色谱方法。采用70%甲醇在70℃恒温水浴回流提取目标物,以0.3%醋酸水溶液-甲醇为流动相,选用Waters sunfire C18色谱柱在277 nm下进行液相色谱分析。该方法线性、精密度和回收率好,检出限和定量限低,适用于连翘叶茶中上述四种活性成分的测定。采用标准方法和自建方法对连翘绿茶(FGT)和连翘红茶(FBT)的营养成分进行了比较分析,其中可溶性糖含量较高(14.15%和15.02%),利于茶汤甘甜滋味及香气形成;FGT的水浸出物(50.62%)、维生素C(48.63 mg/100 g)、总多酚(11.06%)、黄酮(2.39%)、连翘酯苷A(8.77%)、连翘苷(4.98%)和芦丁含量(2.19%)显著高于FBT(p<0.05),其中特征成分连翘酯苷A和连翘苷含量远高于传统中药连翘(果);FBT虽特征成分含量低,但在发酵过程中生成了更易吸收和更强药理活性的连翘脂素(2.88%),含量远高于FGT(0.10%)。此外,FBT茶汤呈橙黄色,含有11.83 mg/100 g的茶黄素。综上,两种连翘叶茶均具有极高的药用价值,极具市场潜力。

连轺化学成分研究

从连轺中分离得到３个化合物。经化学和波谱方法鉴定，它们分别是熊果酸（ｕｒｓｏｌｉｃａｃｉｄ，Ⅰ），连翘甙（ｐｈｉｌｌｙｒｉｎ，Ⅱ）和连翘脂素（ｐｈｉｌｌｙｇｅｎｉｎ，Ⅲ），均为首次从连轺中分离而得。

连翘苷的提取分离与微生物转化

目的研究一种从连翘果实中分离连翘苷的有效方法,并利用提取分离出的连翘苷作为底物,为其转化产物连翘脂素的工业化生产提供研究基础。方法利用70%乙醇对2.5 kg连翘干燥果实进行粗提,萃取乙酸乙酯部位,经过层析得到连翘苷纯品;选择32种菌株对连翘苷进行微生物转化,以连翘脂素的产量为指标,利用微生物转化工艺,筛选出有较强的转化能力且专一性的菌株。结果分离纯化得到目标化合物连翘苷6.8 g,经高效液相色谱分析显示连翘苷纯度在98%以上。经初筛、复筛获得2种菌株具有较强的转化能力且有专一性,分别为雅致小克银汉霉(CGMCC 3.1207)和产黄青霉(CGMCC 3.521)。结论该实验为连翘脂素的制备探索出一条适用于工业化的生产方法,筛选出了能将连翘苷转化为连翘脂素的高效专一性菌株,具有一定的工业化价值。

青翘和老翘中多种成分含量的比较

目的:测定并比较青翘与老翘中连翘酯苷,连翘苷和连翘脂素的含量。方法:以HPLC法测定青翘与老翘中连翘酯苷,连翘苷和连翘脂素的含量。连翘酯苷,连翘苷和连翘脂素分别在3.65μg.mL-1～116.67μg.mL-1,0.31μg.mL-1～10.0μg.mL-1和0.31μg.mL-1～9.89μg.mL-1范围内线性良好。R均大于0.999,回收率均≥90%。结果:青翘中的连翘酯苷为老翘的10.67倍,连翘苷相近,连翘脂素为老翘的1/2倍。结论:在治疗疾病的过程中,应该根据疾病的不同和青翘、老翘所含成分含量的差别选择用药。

连翘苷元通过抑制TLR4介导的NF-κB信号通路减轻大鼠骨关节炎软组织损伤和基质降解

目的研究连翘苷元调控TLR4介导的NF-κB信号通路的活化对骨关节炎大鼠软组织损伤和基质降解的影响。方法建立骨关节炎大鼠模型,将大鼠随机分为6组:健康对照组,模型组,连翘苷元低、中、高剂量组和双醋瑞因组进行后续实验;苏木素-伊红染色和番红O-固绿染色检测大鼠骨关节病理损伤程度;ELISA检测炎症因子的含量;蛋白免疫印迹检测半胱氨酸蛋白酶-3、半胱氨酸蛋白酶-9、聚集蛋白聚糖、基质金属蛋白酶13、Ⅱ型胶原蛋白、Toll样受体4、髓样分化因子88、核因子κB蛋白表达水平。结果与模型组相比较,连翘苷元中、高剂量组和双醋瑞因组骨关节病理损伤程度明显改善,Caspase-3、Caspase-9蛋白水平显著降低(P<0.05),Bcl-2/Bax比值显著升高(P<0.05),Aggrecan、type II collagen(ColⅡ)蛋白水平显著升高(P<0.05),MMP-13蛋白水平显著降低(P<0.05),IL-6、IL-17、TNF-α、MCP-1含量显著降低(P<0.05),TLR-4、MyD88、NF-κB p65蛋白水平显著降低(P<0.05)。结论连翘苷元抑制TLR4介导的NF-κB信号通路的活化对骨关节炎大鼠软组织损伤和基质降解具有修复作用。

连翘抗炎药效物质基础筛选研究

主要探索连翘几种成分的抗炎活性,并筛选其抗炎药效物质基础,为连翘抗炎新药的开发提供参考依据。建立二甲苯致小鼠耳肿胀模型,计算肿胀度。采用酶联免疫法(ELISA)测定小鼠血清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素-6(IL-6)的含量。对比各组的肿胀度及TNF-α和IL-6的含量。连翘苷对小鼠耳肿胀度及TNF-α和IL-6的生成无明显抑制作用,与空白组相比无显著性差异(P>0.05)。连翘脂素、连翘酯苷A、连翘酯苷B均能有效抑制小鼠耳肿胀及TNF-α和IL-6的生成,与空白组相比有显著性差异(P<0.05)。由此可见对所筛选的连翘4种成分,通过口服给药的方式,连翘抗炎药效物质有连翘脂素、连翘酯苷A和连翘酯苷B。通过口服给药,尚未发现连翘苷的抗炎活性,而连翘脂素、连翘酯苷A及连翘酯苷B显示较强的抗炎活性。同时推测其抗炎机制可能与抑制TNF-α和IL-6这两种炎症因子的生成和多成分作用有关。

连翘脂素对LPS诱导RAW264.7细胞炎症反应的影响

为研究连翘脂素的抗炎效应及其抗炎机制,以地塞米松作为阳性对照,建立脂多糖(LPS)诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7炎症模型,检测炎症因子的释放及相关蛋白和mRNA的表达,以期提高对连翘脂素抗炎作用的全面认识并为连翘脂素临床开发提供有力的科学依据。实验采用Griess法检测细胞上清液中NO含量,ELISA法检测TNF-α和IL-6的含量,Westernblot法检测iNOS、COX-2蛋白的表达,RT-qPCR法检测iNOS、COX-2mRNA的表达。与LPS组比较,连翘脂素组和地塞米松组可以明显降低LPS诱导的RAW264.7细胞释放NO、TNF-α和IL-6的量,并呈现浓度依赖关系。Westrenblot和RT-qPCR结果显示连翘脂素能抑制LPS诱导的iNOS、COX-2的蛋白表达以及mRNA的表达,并呈浓度依赖关系。实验研究表明连翘脂素能够明显抑制LPS诱导的RAW264.7细胞炎症因子的释放,iNOS、COX-2蛋白及mRNA的表达从而抑制炎症反应。

连翘花美白活性有效部位的筛选及其成分分析

本文以山西产连翘花为实验原料,采用RP-C18中低压制备分离技术,对连翘花水提物(LQH-W)进行了有效部位的初步制备,得到五个组分。对初提物和五个组分进行了酪氨酸酶抑制活性的测试,结果显示各组分均表现出了较好的抑酶活性,其中组分LQH-W-4的抑酶活性与阳性对照物熊果苷相当,其IC_(50)值为0.668mg·mL^(-1)。继续对各有效部位进行了抗氧化能力测试,结果显示各有效部位均表现出较好的清除DPPH·能力,显示出一定的抗氧化能力,这表明连翘花的抑酶活性应该与其抗氧化能力相关,其抗氧化作用可能是连翘花美白功效的作用机制。进一步对各有效部位进行了总酚、总黄酮含量测定,结果显示各有效部位的总酚和总黄酮含量较高,且各有效部位的含量差异顺序与其抗氧化顺序有一致性,表明黄酮、总酚类物质可能是连翘花起美白作用的物质基础。最后对各有效部位进行了HPLC分析,结果表明各有效部位的化学成分差异较大,其中抑酶活性最好的有效部位LQH-W-4中有两个含量较突出的成分,经标品比对其中之一是连翘脂素,为木脂素酚类成分,有研究表明其确有抑制B16黑色素瘤细胞内酪氨酸酶的作用。

连翘脂素对脂多糖联合正常人血浆诱导的A549细胞炎症损伤的作用

目的通过脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)联合正常人血浆(NHP)刺激A549细胞,探究连翘脂素(phillygenin,PHI)对A549细胞炎症损伤的干预作用及机制。方法采用1 mg·L^(-1)LPS联合5%NHP刺激A549细胞建立炎症损伤模型。MTT和Hoechst 33342染色检测PHI对细胞活力、数目、面积、形态和DNA含量的影响。采用ELISA、免疫荧光染色和实时荧光定量PCR检测炎症因子、NF-κB p65入核及mRNA表达;Western blot检测NF-κB和MAPK关键蛋白表达。结果LPS联合NHP共刺激组IL-6、IL-8含量及NF-κB p65核内转录活性明显上调;PHI(1、10、50和100μmol·L^(-1))可以剂量依赖性降低IL-6和IL-8表达、NF-κB p65核内转录活性及p65 mRNA表达,明显下调IκBα、p65及p38、JNK、ERK蛋白磷酸化水平,上调IκBα表达。结论LPS联合NHP可以成功诱导A549炎症损伤模型,PHI可抑制该炎症反应,其机制与抑制LPS-TLR4-NF-κB/MAPK信号通路的活化有关。

HPLC-ESI/MS法测定不同连翘有效成分的含量

利用高效液相色谱-电喷雾/质谱(HPLC-ESI/MS)分析鉴定不同产地的连翘,包括青翘和老翘中主要有效成分连翘苷、连翘酯苷A和连翘酯素的含量,以此探讨各产地连翘品种主要成分之间的变化及差异程度,为建立野生连翘中药资源综合评价提供科学依据。通过采集中国3个主产地野生连翘6个样品,选用Hypersil Gold C18色谱柱(100.0 mm×2.1 mm,5μm),柱温30℃,以甲醇-水溶液(含体积分数为0.01%甲酸)为流动相进行梯度洗脱,流速为0.55 m L/min,进样量10μL;加热式电喷雾电离源为正、负离子模式监测,源喷雾电压为3.0 k V,鞘气流速为8.0 L/min,离子传输毛细管温度为320℃。研究结果表明:连翘酯苷A和连翘苷两种化学成分的峰面积和浓度在测定浓度范围内均具有良好的线性关系,加样平均回收率分别为113.4%和90.5%,相对标准偏差分别为8.20%和8.30%。

连翘茎中3种木脂素类化学成分的含量测定

建立一种用于测定连翘茎中木脂素类成分连翘苷、牛蒡苷元和连翘脂素含量的HPLC方法,并探索不同月份连翘茎中各成分的含量变化规律,为合理开发利用连翘茎资源提供依据。采用Agilent C18柱;流动相为甲醇-0.3%乙酸溶液,流速为0.8 mL·min^-1,检测波长为280 nm,柱温为25 ℃,进样量为10 μL。连翘苷在10~300 μg·mL^-1,牛蒡苷元在2~50 μg·mL^-1,连翘脂素在2~50 μg·mL^-1呈良好的线性关系,平均加样回收率分别为98.55%,97.55%,98.65%,RSD分别为2.96%,2.27%,2.87%。此外,4月和8月采集的连翘茎中连翘苷含量较高,分别为1.68%和0.72%。本研究建立的方法稳定性好、重复性较好,可用于连翘茎中连翘苷、牛蒡苷元、连翘脂素的含量测定;另外,连翘茎中含有较丰富的连翘苷成分,因此,可作为连翘苷制备的原料来源。

利用发酵法提高连翘叶中连翘脂素含量的方法研究

利用植物自身酶对苷类化合物的酶解转化能力,采用发酵技术研究了连翘叶中连翘苷酶解转化为连翘脂素的较适宜发酵条件。首先考察了连翘叶含水量、发酵温度和发酵时间等单因素对连翘脂素转化生成量的影响,然后利用响应面优化法进一步优化了发酵转化条件。结果表明,在水分含量50%,发酵时间100 min,发酵温度30℃条件下,连翘叶中连翘苷可有效转化生成连翘脂素,且连翘脂素含量从1.67 mg·g^-1提高到46.40 mg·g^-1。本研究确定的方法可为利用连翘叶资源制备连翘脂素提供基础。

人源肠道菌中转化连翘苷制备连翘脂素的菌株筛选及固定化

为了实现生物转化连翘苷制备连翘脂素,本文以连翘脂素得率为指标,采取涂布平板法和16S rDNA测序对人源肠道菌中可以转化连翘苷生成连翘脂素的菌株进行了筛选和鉴定;为了提高菌株的使用稳定性和效率,利用微生物固定化技术,优化了固定化菌球的制备工艺以及转化连翘苷制备连翘脂素的工艺条件。从人源肠道菌中筛选到一株菌为肠杆菌科埃希氏属大肠杆菌(Escherichia coli),该菌株可高效转化连翘苷生成连翘脂素,且无副产物的生成。优化的固定化菌球制备工艺条件为:海藻酸钠浓度3%、氯化钙浓度3.5%、交联时间3 h。固定化菌球在pH值为8、底物浓度为0.8 mg/mL、温度为39℃的条件下,连翘苷在25 h左右可完全转化生成连翘脂素,连翘脂素的平均得率可达97.0%。并且固定化菌球循环使用13次后,连翘苷的转化率仍能达到70.2%。

连翘红茶中连翘脂素的提取方法研究

以连翘红茶为原料,对其提取分离连翘脂素方法进行研究。以连翘脂素的质量浓度作为指标,采用超高压液相色谱进行分析检测,比较不同柱材料和重结晶条件对连翘脂素的分离纯化能力。最佳方法:利用75%乙醇回流提取,水洗两次,D101大孔吸附树脂70%洗脱7BV,重结晶四次,四道工序七步操作即可得到了纯度98%的连翘脂素,总收率49%。整个提取分离方法具有得到的连翘脂素纯度高,回收率高,不使用易燃有毒的有机溶剂,对设备的要求低,操作步骤少且简单,大孔吸附树脂可重复多次使用等特点。