Livin mRNA的反义核酸诱导MCF-7乳癌细胞凋亡作用(英文)

目的 :以livinmRNA为靶点设计反义硫代脱氧寡核苷酸 (PS ODNs) ,探讨其体外抗肿瘤效应及其机制。方法 :设计以livinmRNA为靶点的反义核酸并作用于MCF 7乳癌细胞 ,用MTT、RT PCR和流式细胞仪检测等方法对其进行评价研究。结果 :在设计的一些反义核酸中 ,YMZ0 5能够有效地抑制livin基因的表达 ,增加caspase 3的活性 ,诱导MCF 7细胞凋亡 ,明显抑制其生长 ,结论 :通过抑制livin基因的表达能够抑制MCF 7乳癌细胞生长、诱导其凋亡 ,livin可能会成为抗肿瘤的新靶点。

硫代磷酸酯寡核苷酸的合成及其对内皮细胞组织因子(Tissue factor,TF)基因表达及TF促凝活性的作用

为合成与 TF基因启动子区切应力反应元件 ( Shear stress responsive element,SSRE)形成三链 DNA的硫代磷酸酯寡核苷酸 ( Triple helix- forming phosphorothioate oligodeoxynucleotides,TFO- ps) ,探讨其对内皮细胞TF基因表达及 TF促凝活性的影响。我们设计反向 TFO ( T2 1GTa)序列 ,采用固相亚磷酰胺三酯固相法合成TFO。在 TFO的 3′末端进行硫代磷酸酯修饰。应用电泳迁移分析 ( Electrophoretic mobility shift assays,EMSA)观察寡核苷酸和硫代脱氧寡核苷酸的亲和性。在 ECV3 0 4内皮细胞株观察 γ- 32 P标记硫代磷酸酯 TFO的细胞摄取及其对 TF基因表达的影响。结果显示 ,TFO- ps( T2 1Gta- ps)与靶序列能形成三链 DNA,其 Kd值为 3 .6× 10 - 1 0 M。在内皮细胞株 ECV3 0 4细胞 ,TFO- ps( T2 1GTa- ps)的细胞吸收率为 11.65 % ,主要分布在核沉淀 ,约占吸收总量的77.2 5 % ,显著降低内皮细胞 TF基因 m RNA表达及 TF蛋白合成的平均光密度 ( AOD)值 ,显著降低 TF的促凝活性。以上结果表明 ,TFO- ps( T2 1GTa- ps)具有较好的抗凝活性 ,其机制与抑制

反义寡核苷酸对丙型肝炎病毒调控基因表达的体外抑制活性研究

为探讨反义寡核苷酸（ Ａ Ｓ Ｏ Ｄ Ｎｓ） 对丙型肝炎病毒（ Ｈ Ｃ Ｖ） 的抑制活性，研究和开发新型抗 Ｈ Ｃ Ｖ 药物。采用 Ｈ Ｃ Ｖ ５′ Ｎ Ｃ Ｒ 调控荧光素酶基因的稳定表达细胞株 Ｈｅｐ Ｇ２９７０６ ，评价了３ 条针对 Ｈ Ｃ Ｖ 调控基因的 Ａ Ｓ Ｏ Ｄ Ｎ，即 Ｈ Ｃ Ｖ３６３ 、 Ｈ Ｃ Ｖ３４９ 及 Ｈ Ｃ Ｖ２７９ 。将 Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ 包封的 Ａ Ｓ Ｏ Ｄ Ｎ 与 Ｈｅｐ Ｇ２９７０６ 细胞株每天作用５ 小时，连续３ 天后检测荧光素酶活性。结果提示，在 Ｈｅｐ Ｇ２９７０６细胞中，三种 Ａ Ｓ Ｏ Ｄ Ｎｓ 均具有特异性的剂量依赖性抑制活性。浓度在０５μｍｏｌ／ Ｌ 时， Ｈ Ｃ Ｖ３６３ 、 Ｈ Ｃ Ｖ３４９ 及 Ｈ Ｃ Ｖ２７９ 对 Ｈ Ｃ Ｖ５′ Ｎ Ｃ Ｒ 调控荧光素酶表达抑制率分别为６１ ％ 、５５ ％ 及４８ ％ 。 Ｈ Ｃ Ｖ３６３ 连续作用８ 天，其抑制率可达８１ ％ 。上述资料论证了 Ｈ Ｃ Ｖ３６３ 、 Ｈ Ｃ Ｖ３４９ 及 Ｈ Ｃ Ｖ２７９ 在 Ｈ Ｃ Ｖ５′ Ｎ Ｃ Ｒ 调控荧光素酶基因的稳定表达细胞中对 Ｈ Ｃ Ｖ 调控基因具有明显的抑制活性。

氚标记的Bcl-2反义核酸(F951)在小鼠体内的药代动力学实验研究

目的 研究一种新的氚标记的Bcl 2反义寡核苷酸 3H F95 1单次静脉注射后在小鼠体内的药代动力学过程。方法 用氚标记F95 1,用液闪仪检测放射性浓度 ,用 3P87软件判断房室模型 ,计算各种参数。用液闪仪检测3H F95 1在小鼠体内各器官中的分布浓度 ,检测给药后 72h内药物从小鼠尿和粪中排泄的量。结果 3H F95 1单次静脉注射后在小鼠体内的动力学过程符合二室模型 ,3种剂量时主要的参数血浆分布半衰期 (T1/ 2α)在 10～ 15min之间 ,消除半衰期 (T1/ 2 β)在 2～ 4 5h之间。3H F95 1在肾、肝、脾、骨髓中分布浓度高于其它器官 ,在心、肺、脑、肠、皮肤、脂肪、生殖腺中也有低水平的分布。3H F95 1主要经肾从尿中排泄 ,给药后 2 4h内的累积排泄量占给药量的 5 0 47%。3H F95 1从粪中排泄的量甚微。结论 3H F95

大蒜素抑制人肝癌细胞中VEGF mRNA表达的研究

目的 研究大蒜素对人肝癌细胞中VEGFmRNA表达的影响。方法 应用逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)方法。以HPRT (hypoxanthinephosphoribosyltransferase)为内标。结果 大蒜素有明显抑制人肝癌细胞VEGFmRNA表达的作用 ,与对照组相比 ,其VEGFmRNA表达水平降低了约 66 3 6% (P <0 0 5 )。结论 大蒜素是人肝癌细胞表达VEGF基因的调节剂 ,能抑制人肝癌细胞VEGF基因的表达。

EGFR反义寡脱氧核苷酸硫代修饰片段调节人肝癌细胞中E-cadherin mRNA表达的研究

目的：研究表皮生长因子受体（ epidermal growth factor receptor， EGFR）反义寡脱氧核苷酸硫代修饰片段对人肝癌细胞 E-cadherin基因表达调节。方法：应用逆转录聚合酶链反应（ RT-PCR）方法。以 HPRT(hypoxanthine phosphoribosyltransferase)为内标，分析 3.2μ mol/L浓度的 EGFR反义寡脱氧核苷酸硫代修饰片段在作用 84 h时对人肝癌细胞基因 E-cadherin mRNA表达水平的影响。结果： EGFR反义寡脱氧核苷酸硫代修饰片段有明显的刺激人肝癌细胞表达 E-cadherin的作用，与正常对照组相比，其 E-cadherin mRNA表达水平增高约 66.36％（ P< 0.05）。结论： EGFR反义寡脱氧核苷酸硫代修饰片段是人肝癌细胞表达 E-cadherin基因的调节剂，能刺激人肝癌细胞 E-cadherin基因的表达 ;本研究为预防和治疗肝癌的侵袭转移提供了新的途径和方法。

硫代寡核苷酸在小鼠体内脏器生物分布研究

探讨硫代寡核甘酸 (PSODN)在小鼠体内脏器生物分布。合成互补于乙型肝炎病毒pre -c/c基因的PSODN :5’ -CATGCCCCAAAGCCAC - 3’ ,用T4多核苷酸激酶进行 5’端3 2 P标记后 ,小鼠尾静脉给药 ,分别于不同时间点处死小鼠并取各脏器及血液 ,液相闪烁计数仪测放射性计数。PSODN在血中很快清除 ,半衰期约 1～ 2分钟 ;在所有脏器中 ,肝摄取量最高 ,30分时脏器放射性大小依次为肝 >肾 >肺 >心 >脾 >脑。随后 ,肝脏放射性逐渐降低 ,2 4小时后是所给药物的 2 93%。肝脏作为反义治疗的靶器官有现实意义 ,建议PSODN给药间隔为 2

低pH毛细管区带电泳法分离寡核苷酸和硫代反义寡核苷酸

在低pH条件下采用毛细管区带电泳法对寡核苷酸（PO-ODNs）及具有药用价值的硫代反义寡核苷酸（PS-ODNs）药物“癌泰得”系列样品（18～20mers）进行分离，并系统考察优化了缓冲溶液的pH、缓冲溶液的种类及浓度、添加剂的种类及浓度、电压、温度等因素对样品单碱基分离的影响。其中缓冲溶液的pH对分离起决定性的作用，而添加剂尿素的加入显著提高了PS-ODNs样品的分离度。结果表明，采用末涂层弹性石英毛细管（50μm，总长49．0cm，有效长度40．7cm），以50mmol／L磷酸二氢钠-磷酸（pH2．24）-7 mol／L尿素为缓冲溶液，压力进样（2kPa×10s），负极进样，正极检测，在分离电压-20kV、柱温25℃、检测波长260nm条件下，可实现寡核岢酸及硫代反义寡核苷酸混合样品的单碱基分离。PO—ODNs的18～19mers及19～20mers样品的平均分离度分别为4．68，3．20；PS—ODNs的18～19mers及19～20mers样品的平均分离度分别为1．23及0．81．该法操作简单，重现性好，可为反义寡核苷酸药物的分析提供借鉴．

联合新型Bcl-2反义核酸与足叶乙苷抑制人小细胞肺癌细胞的增殖

目的 研究一种新型Bcl 2反义寡核苷酸 F95 1在与足叶乙苷 (VP16 )联合使用时 ,对人小细胞肺癌细胞增殖的影响。方法 分别单独及联合应用F95 1、VP16于人小细胞肺癌细胞株NCI H4 4 6 ,通过MTT法检测细胞存活率 ,通过集落形成法检测集落生存率 ,按Welander法计算联合应用组的预测值 ,通过实测值与预测值的比较进行效应分析。结果 细胞存活率 (MTT法 )和集落生存率 (集落形成法 )均显示联合应用F95 1、VP16组的实测值明显低于预测值。结论 联合应用F95 1与VP16对人小细胞肺癌细胞的增殖有协同的抑制作用。

Bcl-2反义核酸联合化疗药对HL60细胞及原代白血病细胞的作用

目的应用Bcl-2反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸(anti-sense phosphorothioate oligodeoxynucleotide,AS-PS-ODNs,AS-PO)靶向诱导20例原代急性白血病细胞凋亡,并与多种常用化疗药联合,观察ASPO对原代急性白血病细胞及HL60细胞系的协同效应。方法①应用MTT比色法分析ASPO与常用化疗药物配伍协同作用特点;②细胞免疫化学染色检测P26 Bcl-2蛋白表达;③台盼蓝拒染试验检测白血病细胞倍增时间;④丫啶橙(AO)染色,流式DNA Content分析细胞凋亡率,电镜及DNA电泳观察凋亡细胞形态及分子水平的变化。结果①ASPO与除DNR,NVT外的7种(HHRT,VCR、MTX、Ara-c、VP16、ACR、DEX)化疗药物均有联合增强或相加作用。②12例Bcl-2蛋白抑制率大于0.4为A组,8例小于0.4为B组。A组的凋亡率和B组的凋亡率均高于空白对照组(P<0.05),且A组的凋亡率高于B组(P<0.05)。③原代急性白血病细胞ASPO组,Ara-c组和ASPO+Ara-c组,72 h细胞生长抑制检测发现ASPO+Ara-c组的细胞抑制率高于单用ASPO与单用Ara-c的细胞抑制率之和(P<0.01);④A组的ASPO对细胞的抑制与细胞生长的倍增时间102.89±37.97呈正相关γ=0.577(P<0.05)。结论Bcl-2 ASPO能特异抑制白血病细胞(系)的Bcl-2蛋白表达;Bcl-2 ASPO对倍增时间慢、BCL-2蛋白表达高的原代白血病细胞作用效果好;Bcl-2的ASPO与多种化疗药物联合有潜在临床应用前景。

反义寡聚脱氧核苷酸（ODN）衍生物抑制乙肝病毒抗原表达的研究

为比较针对中不同基因的ＯＤＮ硫代衍生物阻断乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）的抗原表达，合成了与核心蛋白编码基因起始码上游序列（＃１８９３－１９０７），多聚酶蛋白编码基因起始码上游及内部序列（＃２２９７－２３１３，＃２７９７－２８１３）３．５ｋｂＲＮＡ３′端起始负链ＤＮＡ合成序列（＃ｌ８１７－１８３１）互补的寡聚脱氧核苷酸硫代衍生物［Ｃ－ＯＤＮ，Ｐ－ＯＤＮ，ＰＭ－ＯＤＮ，ＰＢＳ－ＯＤＮ］，分别在ＨＢＶ短暂表达和稳定表达细胞培养系统中观察其抑制ＨＢＶ抗原表达的作用。结果发现，当培养液中ＯＤＮ浓度为２０μｍｏｌ／Ｌ时，四种ＯＤＮ均能抑制ＨｅｐＧ２２．２．１５细胞ＨＢｓＡｇ（乙肝表面抗原）的产生（抑制率分别为：Ｃ－ＯＤＮ，２４．５％；ＰＯＤＮ，１３．４％；ＰＭ－ＯＤＮ，３８．４％；ＰＢＳ－ＯＤＮ，２８．４％）；与ＨＢＶＤＮＡ双体质粒共转染ＨｅｐＧ２细胞后部分ＯＤＮ可明显抑制ＨＢＶＤＮＡ在细胞内表达（ＨＢｅａｇ分泌抑制率分别为：Ｃ－ＯＤＮ，５２％；ＰＭ－ＯＤＮ，７０％；Ｐ－ＯＤＮ，４８％；ＰＢＳ－ＯＤＮ，１８％）。用测定上清中人白蛋白的结果证明，Ｃ－ＯＤＮ的细胞毒作用最低。对Ｃ－ＯＤＮ的作用机理及进一步发展ＯＤＮ的应用也进行了?

肝细胞靶向pH敏脂质体介导的硫代反义寡核苷酸对HCV5′NCR基因表达的抑制作用

反义寡核苷酸是一种阴离子大分子物质 ,细胞生物利用度较低且易被细胞溶酶体酶降解 ,为了增强反义药物在病变靶细胞内的有效浓度 ,根据受体介导的内吞作用原理 ,针对肝细胞专一性表达的去唾液酸糖蛋白受体 ,设计及制备了一种肝靶向性脂质体 ,这种脂质体同时具有pH敏性。采用竟争抑制实验及鸡红细胞溶血实验分析了其肝细胞靶向性及pH敏性 ;应用肝靶向pH敏脂质体作为药物运载工具 ,介导反义寡核苷酸HCV3 63作用于转基因细胞HepG2 .970 6细胞 ,通过荧光素酶活性检测 ,观察了硫代反义寡核苷酸对HCV 5′NCR调控功能的抑制活性。结果显示 ,不同浓度半乳糖溶液对 5 % 18 gal脂质体有一定的抑制作用 ,浓度超过 2 0mmol L时 ,达到饱和 ,最大抑制率为 3 8% ;溶血实验显示脂质体与红细胞膜融合作用有显著的pH值依赖性 ,pH <6时 ,血红素释放量明显增加 ;肝靶向pH敏性脂质体介导的HCV3 63对HepG2 .970 6细胞中HCV 5′NCR调控基因具有显著的剂量依赖性抑制作用 ,浓度为 1 0 μmol L时 ,抑制率达 86%。综上 ,所制备的脂质体具有一定的肝细胞靶向性及显著的pH敏感性 ,这种脂质体能够增强HCV特异性硫代反义寡核苷酸的细胞内抑制活性 ,这为针对肝炎病毒的反义寡核苷酸的体内活性评价提供了有用的转运体系。

反义药物作用中的“靶二级结构域”

目的 在计算机模拟mRNA二级结构与定量构效关系分析的基础上优化反义药物设计。方法 使用软件RNAstructure模拟mRNA二级结构 ,针对二级结构单元进行反义药物设计 ,用肺腺癌细胞株A5 49评价反义药物的体外抗肿瘤生物活性 ,用软件SPSS进行多元回归分析。结果 有效药物作用靶点相对集中地分布于由若干二级结构单元组成的局部二级结构区域。我们称之为“靶二级结构域 (靶域 )”。“靶域”结构相对稳定 ,但其中包含不稳定二级结构单元 (ΔG° >0 )。针对不同“靶域”设计的反义药物显示不同的生物活性 (P <0 0 1) ,但靶向同一“靶域”的反义药物生物活性无统计差别。结论 “靶域”现象有助于反义药物靶点的选择 ,并对探针。

硫代磷酸反义寡脱氧核苷酸抗HBV细胞的实验研究

针对ＨＢＶ的５个基因位点作为靶序列，设计合成硫代反义寡聚核苷酸（Ｓ－ａｓＯＤＮ）．应用ＥＬＩＳＡ方法、ＭＴＴ比色法、电子显微镜等手段，观察Ｓ－ａｓＯＤＮ对ＨｅｐＧ２２２１５细胞ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ抗原的表达，及细胞的毒性、细胞形态和超微结构的影响．结果显示不同靶位点的Ｓ－ａｓＯＤＮ对ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ表达都有显著的抑制作用，且表现为序列特异性、剂量相关性、联合协同性和一定的抗核酸酶性，在浓度为２０μｍｏｌ／Ｌ时，对细胞无明显杀伤作用，对细胞的超微结构无显著的改变．结果提示Ｓ－ａｓＯＤＮ有望发展为抗ＨＢＶ的有效药物，但靶序列的选择、透细胞膜性及联合用药配伍等仍值得进一步研究和解决．

寡核苷酸骨架对CpG基元诱导人巨噬细胞释放细胞因子的影响

目的 探讨不同寡核苷酸骨架对GG 寡核苷酸CpGODNs导致小鼠死亡、诱导细胞因子释放能力的影响。方法 实验前 1h经腹腔注射 6 0 0mg/kgD 氨基半乳糖敏化小鼠 ,采用磷酸硫化CpG 寡核苷酸 (PsCpGODN)、Psnon CpGODN、磷酸二酯CpG 寡核苷酸 (PoCpGODN )和Ponon CpGODN腹腔注射小鼠 ,注射剂量为每只小鼠 10nmol ,观察 7d内小鼠死亡率的差异。体外培养THP 1细胞系 ,在THP 1细胞培养体系中加入上述制剂后 ,37℃、5 %CO2 孵箱中培养 2 0h后离心取上清 ,测定上清中TNF α、IL 6、IL 12的浓度。同时观察CpGODN刺激THP 1细胞 4h后TLR9的表达情况。结果 PsCpGODN可诱导小鼠的死亡以及细胞因子的大量释放 ,而其它三种制剂则无此能力 ;而且PsCpGODN诱导TNF α释放的能力随浓度的增加而增加 ;CpGODN导致的细胞TLR9的表达增加与细胞因子的释放密切相关。结论 磷酸硫代骨架的CpGODN具有导致动物死亡和诱导巨噬细胞大量释放细胞因子的作用 ,磷酸二酯骨架的CpGODN则无此能力。

VEGF反义核酸对HL-60细胞作用和机制研究

本研究探讨血管内皮生长因子 (VEGF)反义核酸对HL 6 0细胞生长的量效和时效关系 ,并研究其作用机制以揭示VEGF基因新的功能。用含 2 0个脱氧核糖核酸的反义核酸A7(用计算机模拟设计和实验筛选出的最优序列 )全硫代修饰 ,以脂质体介导进入细胞 ,培养 72小时后用MTT法计算细胞生长抑制率 ;采用台盼蓝拒染法每2 4小时观察细胞存活情况并计数 ;用Giemsa染色观测细胞形态学改变 ;用流式细胞仪检测细胞凋亡百分数 ;用VEGFELISA试剂盒测定蛋白的水平。结果显示 ,反义药物对HL 6 0细胞生长有明显抑制作用 ,呈剂量依赖关系 ,并且下调VEGF蛋白的表达 ;反义药物对HL 6 0细胞的凋亡无明显影响。结论 :VEGF反义药物抑制HL 6 0细胞生长的机制是抑制细胞增殖 ,而不是促进细胞凋亡 ,内源性VEGF蛋白具有促进HL 6 0细胞增殖的功能。

bcl-2、IL-6、IL-6R反义寡脱氧核苷酸对小细胞肺癌细胞作用的比较

目的:比较bcl-2、白介素-6(interleukin-6,IL-6)、白介素-6受体(interleukin-6 receptor,IL-6R)反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸(antisense phosphorothiate oligodeoxynucleotide,AS-PS-ODN)对小细胞肺癌细胞株NCI-H446细胞增殖及诱导凋亡的作用,初步探讨反义核苷酸技术治疗中靶基因的选择策略。方法:合成反义寡脱氧核苷酸bcl-2AS-PS-ODN、IL-6AS-PS-ODN、IL-6RAS-PS-ODN,分别作用于NCI-H446细胞株,通过细胞克隆形成实验检测细胞增殖活性的变化,细胞凋亡线粒体流式检测及DNA倍体分析检测细胞凋亡,半定量RT-PCR检测相关基因表达水平的变化。结果:(1)bcl-2AS-PS-ODN、IL-6AS-PS-ODN、IL-6RAS-PS-ODN均能够抑制肺癌细胞增殖活性和诱导细胞凋亡,其中以IL-6AS-PS-ODN抑制作用最强,bcl-2AS-PS-ODN次之,IL-6RAS-PS-ODN作用最弱。(2)3种反义寡脱氧核苷酸均能下调肺癌细胞相应基因的表达水平,其中以IL-6下调幅度最大,达(84.1±5.01)%;bcl-2和IL-6R基因下调幅度相近,分别为(62.6±3.42)%和(60.3±4.45)%。(3)反义核苷酸作用后除了引起自身基因表达下调外,还伴对其他基因表达的调节作用,如IL-6AS-PS-ODN作用使bcl-2基因表达下调(32.2±0.20)%;而bcl-2AS-PS-ODN作用使IL-6基因表达上调(74.3±4.13)%。结论:IL-6AS-PS-ODN较bcl-2AS-PS-ODN和IL-6RAS-PS-ODN能更有效地诱导小细胞肺癌细胞凋亡,IL-6是NCI-H446小细胞肺癌反义核苷酸治疗较为合适的靶基因。

端粒酶hTERT基因反义核酸对膀胱癌细胞T24端粒酶活性的影响

目的探讨hTERT基因的全硫代修饰反义寡核苷酸(ASPS-ODN)对膀胱癌细胞T24端粒酶活性的影响。方法采用TRAP-PCR-ELISA法检测膀胱癌细胞的端粒酶活性;采用RT-PCR方法检测hTERT基因mRNA的表达水平;以免疫组化通过流式细胞仪检测hTERT基因蛋白水平的变化。结果hTERT基因的全硫代修饰反义寡核苷酸(ASPS-ODN)作用于T24细胞48h,其端粒酶活性下降,作用72h,其端粒酶活性受到抑制。结论通过hTERT基因的全硫代修饰反义寡核苷酸(ASPS-ODN)特异性抑制hTERT基因mRNA的表达降低膀胱癌细胞T24端粒酶活性。

抑制脑血栓形成的硫代磷酸酯脱氧寡核苷酸的亲和性研究

目的为抑制脑血栓形成,合成与TF基因启动子区切应力反应元件(SSRE)形成三链DNA的硫代磷酸酯寡核苷酸(TFO)。方法设计TFO序列14条,采用固相亚磷酰胺三酯固相法合成TFO。硫代磷酸酯修饰在TFO的3'末端进行。应用电泳迁移分析(EMSA)观察寡核苷酸和硫代脱氧寡核苷酸的亲和性。结果在设计合成的14条寡核苷酸中,与靶序列能形成三链DNA的TFO只有T21GTa、T14GTa和T15GTa,其Kd值分别为3.6×10-10、1.0×10-9和1.0×10-8(M),经硫代磷酸酯修饰后分别为:2.3×10-9、3.8×10-9和1.5×10-8。结论硫代磷酸酯修饰的T21GTa-ps、T14GTa-ps和T15GTa-ps能够与TF基因启动子SSRE的3个位点形成三链DNA。