应用光敏生物素探针检测Vero细胞乙脑疫苗中细胞残余DNA

用国产光敏生物素,标记Veto细胞全DNA,通过与疫苗中同源DNA的狭缝杂交,检测Vero细胞乙脑疫苗中细胞残余DNA含量。检测灵敏度可达1pg。探针稳定长达一年。杂交反应特:异性高,结果重复性好。与同位素探针相比,生物素标记探针简便、经济、快速、稳定。由本法测得,Vero细胞乙脑粗制疫苗中,含DNA为200～400pg/0.5ml;超滤浓缩苗为4×10~4～6×10~6pg/0.5ml;通过柱层析和沉淀法提纯的疫苗则分别低于60pg/0.5ml和1pg/0.5ml。本法同样适用于传代细胞制备的其它生物制品中细胞残余DNA的检测。

用光生物素核酸探针检测牛传染性鼻气管炎病毒

用光生物素标记牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitisvirus,IBRV)9.6kb DNA片段做探针,可检测出10pg的IBRV DNA、1个TCID50的病毒和1～10个TCID50的实验感染牛精液。用核酸探针检测IBRV与分离病毒的符合率为84.4％。若将采集的样品在牛肾细胞上增毒一次,再抽提培养物的核酸,用核酸探针检测,则敏感性和符合率大为提高。

应用光敏生物素标记探针检测杂交瘤细胞中小鼠白血病病毒

采用BamHⅠ酶切和琼脂糖凝胶电泳技术，从重组质粒pSF11中回收5kb小鼠白血病病毒（MuLv）DNA片段，用光敏生物素标记制备DNA探针，采用斑点杂交法检测杂交癌细胞，McAb纯品以及SP2／0细胞中的MuLv。结果表明，此探针特异性好，灵敏度可达25pg。在检测的13株杂交瘤细胞和2株SP2／0细胞中分别有5株和1株为MuLv阳性，在McAb纯品中未查出MuLv。

光敏生物素标记流行性出血热病毒R22株M片段cDNA探针的研究

应用光敏生物素标记我国流行性出血热病毒R22株M片段R3克隆cDNA,制备出生物素化的cNNA探针。用此探针与流行性出血热病毒R22株和陈株进行斑点杂交,结果R3克隆与R22株和陈株均出现阳性杂交信号,而与单纯疱疹病毒、柯萨奇B组病毒和正常对照细胞组的杂交结果均为阴性。光敏生物素标记探针可检出10pg的cDNA,并用此方法检测TEHF病毒在感染乳鼠体内的分布情况。

光敏生物素标记核酸探针检测A群轮状病毒的研究

采用光敏生物素标记Ａ群轮状病毒（ＧＡＲＶ）全基因组ＲＮＡ，制备了ＧＡＲＶ群特异核酸探针，该探针与样品进行打点杂交，经亲和素－碱性磷酸酶（ＡＶ－ＡＰ）系统显色，可检出１００ｐｇ病毒ＲＮＡ序列。试验表明轮状病毒光敏生物素核酸探针具有特异、灵敏、稳定的特点，可用于ＧＡＲＶ的检测和进行基因相关性研究。

光敏生物素标记总DNA探针对大豆根瘤菌的检测

以光敏生物素标记慢生型大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)USDA110总DNA作为探针,与快生型大豆根瘤菌杂交时,没有杂交斑点形成,而与慢生型大豆根瘤菌中的部分菌株能形成杂交斑点,表明该探针具有种和部分菌株特异性,用该探针与压碎的根瘤汁液进行DNA杂交,检测USDA110在不灭菌的盆栽土壤中的竞争结瘤能力,发现USDA110在大豆不同生育期的占瘤率为70%～90%。

光敏生物素标记犬细小病毒核酸探针的制备及其应用

将含有犬细小病毒2.0 kb DNA 克隆片段的重组质粒 pBI-264转化大肠杆菌 JF-803,扩增后用碱裂解法提取重组质粒,纯化后电泳,用冷榨法回收克隆片段。用光敏生物素分别标记重组质粒及克隆片段,制成重组质粒探针及克隆片段探针两种核酸探针,它们对犬细小病毒有相同的杂交特异性,检测灵敏度达 pg 水平,保存期至少8个月。检测25份犬粪样,阳性率为32%(8/25),而 HA-HI 试验为24%(6/25),两种方法的符合率为92%(23/25)。本试验从粪样直接提取病毒 DNA,用非放射性的光敏生物素标记探针检测,方法简便,可直接应用于兽医病毒学诊断。

用光生物素标记F20探针检测柑桔裂皮病类病毒

用光生物素标记Ｆ２０探针检测柑桔裂皮病类病毒陈纯贤，万蜀渊（武汉华中农业大学柑桔研究所４３００７０）关键词柑桔裂皮病类病毒，Ｆ２０探针，光生物素，斑点杂交核酸分子杂交技术因其灵敏度高、特异性强，也广泛用于病毒和类病毒的检测。最初，一般采用放射性同位素...

光敏生物素标记cDNA探针在肾综合征出血热实验诊断中的初步应用

本文用光敏生物素标记的R3 cDNA探针杂交检测了HFRS患者外周血淋巴细胞、血清和尿沉淀细胞中HFRS病毒核酸。结果42份淋巴细胞标本中30份为阳性,48份血清标本中有24份出现阳性杂交信号,81份尿沉淀细胞标本中53份为阳性,表明将此光敏生物素标记的cDNA探针用于HFRS实验诊断和致病机理的研究是可行的。

应用长臂光敏生物素核酸探针检测医学真菌的研究

〔目的〕建立PCR结合长臂光敏生物素核酸探针杂交检测医学真菌的方法。〔方法〕首先合成医学真菌通用引物 ,用PCR扩增白色念珠菌 18SrRNA基因 ,用长臂光敏生物素标记纯化的扩增产物作为核酸探针 ,然后用此探针对PCR后的基因扩增产物进行Southern杂交检测医学真菌。通过用白色念珠菌感染人鼠 ,建立念珠菌病的实验动物模型 ,验证血培养法、PCR法和PCR扩增及Southern杂交检测医学重要真菌的敏感性。〔结果〕通用引物可以扩增白色念珠菌、热带念珠菌、新型隐球菌、黄曲霉菌、烟曲霉菌等 9种医学常见真菌的 18SrRNA基因 ,扩增片段长度为 62 1～ 687bp。此引物只扩增真菌DNA ,不扩增临床常见的细菌、病毒和哺乳动物组织细胞DNA。利用实验动物模型比较了血培养法、PCR法和PCR扩增及长臂光敏生物素核酸探针Southern杂交法检测真菌血症的灵敏度 ,实验证明后者的敏感性最高。〔结论〕本方法快速、敏感、不需放射性同位素 ,有较好的临床应用前景。

新疆细粒棘球绦虫DNA限制性酶切片段长度多态性的初步分析

应用光敏生物素标记细粒棘球绦虫特异性DNA探针pEG18,对新疆5个不同地区绵羊、1例肝包虫病人、阿勒泰地区牛细粒棘球绦虫原头节以及羊源、牛源细粒棘球绦虫成虫DNA进行限制性酶切谱和Southern杂交分析。牛源、羊源样本经EcoRI酶切后产生的杂交图型基本上是一致的。BamHI酶切后产生的杂交结果,在新疆5个不同地区绵羊感染的细粒棘球绦虫没有发现差别,而人源和牛源细粒棘球绦虫DNA产生的杂交图型与绵羊源细粒棘球绦虫DNA产生的杂交图型大体上是一致的,但又存在着各自的差异。与绵羊样本相比,人源细粒棘球绦虫产生的杂交图型约在8.3kb处明显可见一条杂交带,而牛源细粒棘球绦虫约在3.5kb处有一条清晰的杂交带。这些差异的意义有待进一步研究。用光敏生物素代替同位素标记DNA探针,简便易行,稳定可靠,可取得满意的结果,在边远的地区是一种值得推广的方法。

用光敏生物素标记鸡传染性支气管炎病毒cDNA探针及其应用的研究

应用光敏生物素标记鸡传染性支气管炎病毒ｃＤＮＡ，制备核酸探针、经斑点杂交法和碱性磷酸酶显色后，探针同以ｃＤＮＡ为模板合成的ＰＣＲ产物及其重组子ｐＳＸＩＢＶＳ１均呈现强阳性的蓝色斑点，而与正常尿囊液、新城疫病毒和鸡败血霉形体无杂交。一个初诊为ＩＢ感染的田间病料与探针杂交阳性结果相符合。试验表明该ｃＤＮＡ探针是敏感和特异的检测方法。

长臂光敏生物素和光敏地高辛核酸探针检测医学真菌灵敏度的比较研究

建立应用长臂光敏生物素核酸探针和光敏地高辛核酸探针杂交。检测真菌的方法 ,并比较二者检测临床常见医学真菌的敏感性。设计并合成医学真菌通用引物 ,用PCR扩增白色念珠菌标准株的核糖体RNA基因 ,用长臂光敏生物素或光敏地高辛标记其纯化的扩增产物制备成相应的核酸探针 ,然后用上述两种探针对标本中的PCR扩增产物进行Southern杂交 ,检测医学真菌。通过用白色念珠菌感染大鼠 ,建立念珠菌病的实验动物模型 ,验证血培养法、PCR法和PCR扩增结合Southern杂交 ,检测真菌的敏感性。结果表明 ,这两种核酸探针可分别与白色念珠菌、热带念珠菌、新型隐球菌、黄曲霉菌、烟曲霉菌等 9种真菌杂交呈阳性结果 ;与临床常见的细菌、病毒和哺乳动物组织细胞DNA杂交结果为阴性。利用实验动物模型比较了血培养法、PCR法和PCR扩增结合长臂光敏生物素核酸探针Southern杂交法检测真菌血症的灵敏度 ,实验证明后者的敏感性最高。总之 ,应用长臂光敏生物素核酸探针和光敏地高辛核酸探针与标本PCR扩增物杂交 ,检测上述真菌既特异和敏感 ,又不需放射性同位素。光敏地高辛核酸探针检测医学真菌的灵敏度略高于长臂光敏生物素核酸探针。

光生物素DNA探针的制备及其检测恶性疟原虫DNA的研究

本研究使用光生物素(PHOTOPROBE^(TM) Biotin)标记恶性疟原虫(P.f.)全基因组DNA,含P.f.cDNA片段的重组质粒DNA(C7)及克隆的P.f.cDNA片段(P9-25)等作为探针,并以斑点杂交试验检测靶DNA。实验结果显示,光生物素标记法简单、快速和安全;标记的探针活性较高,于-20℃贮存10个月无明显降低。用生物素化的P.f.全基因组DNA及C7探针分别可检出低至125pg和250pg的纯化的P.f.DNA。

探针pBLU的制备与标记

本文介绍了检查导入改造的谷蛋白基因情况时所用DNA探针的制备与标记.采用长臂光敏生物素取代同位素对探针进行标记,获得大量可长期保存的DNA探针,标记灵敏度达pg级.

生物素标记的人IL-6受体基因探针的制备及在细胞原位杂交中的应用

制备了人IL-6受体cDNA 1.7 kb片段及其胞外区近膜侧区段0.5kb片段,分别用生物素标记制备了人IL-6受体基因探针,用斑点杂交分析了探针的灵敏度和特异性,并将探针用于四种白血病细胞系的原位杂交。结果表明,探针的灵敏度可达15～125pg/μl、特异性较好,所检测的四种细胞的IL-6受体mRNA表达水平与其细胞膜表面IL-6受体表达水平相一致。

光敏生物素和^(32)P标记DNA打点杂交检测钩端螺旋体

应用光敏生物素和^(32)P标记黄疸出血群赖型017株钩端螺旋体DNA(简称017DNA)作为探针,打点杂交检测问号状钩体。结果表明:两种探针均能检测不同群、型的问号状钩体DNA,最小检测量分别为5pg和1pg;与双曲钩体patoc型PatocⅠ株、细螺旋体属illini型3055株及其他致病菌和正常人血清未发现明显杂交信号。提示光敏生物素制备的017DNA探针可以用于检测钩体,也可应用于钩体病的早期诊断和流行病学调查。

猴D型逆转病毒Ⅰ型cDNA合成及其分子克隆的建立

利用随机引物法反转录合成SRV-1 ss-cDNA和ds—cDNA.将ds—cDNA平端连接到质粒pUC19中,转化E.Coli.DH5α菌.氨苄青霉素、X-gal培基和菌落杂交筛选,克隆阳性重组率为20.7%.EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切分析,12.7％的插入片段大于500bp。Southern杂交进一步确证,所选三株重组质粒(pSRV-127、pSRV-156和pSRV-169)的探针用插入片段(0.9kb、1.0kb和1.4kb),是SRV-1 cDNA片段.光敏生物素标记纯化pSRV-169DNA和pSRV-156cDNA片段制备探针,前者用于检测SRV-1病毒RNA,后者用于检测纯化病毒颗粒。碱性磷酸酶系统染色。

光敏生物素标记总DNA探针对大豆根瘤菌的检测

以光敏生物素标记慢生型大豆根瘤菌USDA110总DNA作为探针，与快生型大豆根瘤菌杂交，没有杂交斑点形成．而与慢生型大豆根瘤菌中的部分菌株能形成杂交斑点，表明该探针具有种和部分菌株特异性．用该探针与压碎的根瘤汁液进行DNA杂交，检测USDA110在不灭菌的盆栽土壤中的竞争结瘤能力，发现USDA110在大豆不同生育期的占瘤率为70％～90％．

PRV特异性糖蛋白gp50基因片段的克隆探针制备

在ＢＨＫ２１细胞中增殖伪狂犬病病毒（ＰＲＶ），提纯ＰＲＶＤＮＡ，选编码特异性糖蛋白ｇｐ５０基因中的２６２ｂｐ片段进行ＰＣＲ扩增。扩增产物经ＫｐｎⅠ和ＳａｌⅠ双酶切后，将２２２ｂｐ片段与质粒ｐＵＣ１９连接构成重组子ｐＵＰ。通过转化大肠杆菌ＪＭ８３、Ａｍｐｒ和α互补效应筛选后，扩增、提纯重组子ｐＵＰ，用ＫｐｎⅠ和ＳａｌⅠ酶切，电泳回收克隆的２２２ｂｐ片段。用光敏生物素标记２２２ｂｐ片段和重组子ｐＵＰ制备的探针，分别检出４６．８ｐｇ和９３．６ｐｇ的ＰＲＶＤＮＡ，且ｐＵＰ探针只与ＰＲＶ呈杂交阳性反应，与ＨＳＶ－１、ＨＳＶ－２及ＣＭＶ呈阴性反应。