黑曲霉N25植酸酶phyA基因在巴斯德毕赤酵母中高效表达的研究

从黑曲霉N25(A.niger China strain)中提取出染色体DNA,根据已经测定出的植酸酶phyA基因全序列设计了一对引物,采用高保真度的聚合酶Advangage-HF扩增到了去除信号肽和内含子后约1.4kb片段,对该片段进行了克隆及序列测定。将该序列与植酸酶phyA基因全序列进行了比较。以此片段构建成功了pPIC9K-phyA载体(命名为pPNP-1),并转化毕赤巴斯德酵母。经G418抗性筛选、酶活性测定、Southern印迹和Western印迹,获得了高效表达的转化子PP-NP-1(23869.4u/ml)、PP-NP-2(20533.0u/ml)、PP-NP-3(35646.7u/ml),其酶活性分别是出发菌株的酶活(513.4u/ml)的46.46倍、39.99倍和69.46倍,且转化子具有很好的遗传稳定性。

植酸酶phyA^m基因结构延伸突变改善酶的热稳定性

将来源于黑曲霉N25的植酸酶基因phyAm重组于大肠杆菌表达载体pET30b(+),以重组表达载体pET30bFphyAm为模板经PCR扩增获得结构延伸突变植酸酶基因phyAe(在植酸酶基因C端增加了来源于pET30bFphyAm载体上13氨基酸残基)。含突变基因的重组表达载体pPIC9kphyAe在GS115酵母中表达。纯化的突变酶PPNPe与野生型酶PPNPm8相比:PPNPAe的最适反应温度上升了3℃,75℃处理10min,热稳定性提高21%,比活力略有提高。最适反应pH为5.6,有效pH范围pH4.6到pH6.6。比未突变酶扩大了0.4单位。

高效表达黑曲霉PhyA基因改善白三叶草对有机态磷的利用

利用子叶下胚轴为外植体,通过农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)Ti质粒介导遗传转化途径,建立了高效表达黑曲霉PhyA基因的白三叶草转基因系。PCR和Southern印迹结果表明,PhyA基因已整合到转基因植株的基因组中。Northern印迹结果表明,部分转基因系中的PhyA基因具有高表达水平。此外,PhyA基因表达的植酸酶在Patatin信号肽的引导下具有分泌至细胞间隙和根际的能力。与未转基因对照相比,在以植酸盐为唯一磷素供源的条件下,高表达PhyA的转基因系植株的磷素累积量、鲜重和干重显著增加。证明外源转化黑曲霉PhyA基因能显著增强白三叶草利用有机态磷的能力。

真菌植酸酶phyA基因研究进展

植酸酶是催化植酸及植酸盐水解成肌醇和无机磷酸盐的一类酶。本文综述了真菌植酸酶 (EC 3.1.3 .8)phyA基因的研究进展 ,主要包括 :①phyA基因的分子生物学特点 ;②phyA基因组文库的构建 ;③phyA基因表达载体的构建 ;④phyA基因表达的调控 ;⑤phyA基因克隆及表达实例。

农杆菌介导phyA基因转化玉米愈伤组织培养体系的优化

以根癌农杆菌(Agrobacterium)EHA105介导外源基因phy A转入玉米(Zea mays L.)自交系GS01的胚性愈伤组织,并利用除草剂(草胺磷)筛选出抗性愈伤组织,培养并获得再生植株。结果表明,菌液浓度及侵染时间显著影响愈伤组织的转化率;不同激素种类及配比对抗性愈伤组织再生植株的影响明显。当菌液浓度OD600 nm为0.6,侵染时间为20 min时,抗性愈伤组织的转化率最高,达到了68.7%,为玉米农杆菌转化并获得再生植株奠定了基础。

天女木兰MsPHYA基因的表达及休眠解除功能研究

光敏色素通过感知光信号来参与调控植物种子萌发,其中PHYA是吸收远红光信号的主要光受体。为了探究天女木兰(Magnolia sieboldii K.Koch)种子休眠解除的分子调控机制,对天女木兰光敏色素相关基因PHYA基因(MsPHYA)展开研究。从天女木兰种子中克隆MsPHYA基因(MZ221928)cDNA全长序列,采用qRT-PCR的方法测定MsPHYA基因和MsPIF3基因在不同光质处理下在天女木兰种子中的表达量,MsPHYA基因在天女木兰不同组织中表达量,测定不同光质诱导的种子萌发率,构建pGS-21T-MsPHYA原核表达载体,纯化并复性重组蛋白。研究结果表明:MsPHYA蛋白序列包含PAS结构域、GAF结构域、Phytochrome Region和His kinase结构域。MsPHYA基因在子叶和长枝中高表达,在远红光处理下MsPHYA和MsPIF3基因表达量先升高后下降。不同光质诱导种子萌发率从高到低顺序为红光>黑暗>远红光。天女木兰MsPHYA基因受远红光刺激而上调表达,但远红光处理并没有促进天女木兰种子萌发,推测MsPHYA基因并不直接调控天女木兰种子休眠,其休眠解除同时受MsPIF3调控。成功构建pGS-21T-MsPHYA载体并获得纯化蛋白,制备的MsPHYA抗体具有较好的特异性,可用于蛋白丰度分析。研究结果为揭示光解除种子休眠机制提供理论依据。

phyA基因克隆及其在大肠杆菌中的高效表达

利用自行筛选、鉴定的黑曲霉F246,根据植酸酶(phyA)基因成熟肽编码序列设计引物,直接PCR扩增phyA,经酶切分析、DNA测序分析证实phyA基因克隆成功。从pMD18T-phyA克隆中获得phyA编码序列,将其与pET30a+质粒连接,构建pET30a+-phyA重组质粒,并在大肠杆菌中获得了高效表达。重组质粒经IPTG诱导表达,SDS-PAGE特异区带分子量为50 kDa,此重组蛋白占大肠杆菌可溶性蛋白的36.62%,酶活性较天然植酸酶高8倍以上。本研究为大量获得高活性植酸酶以及开发新型微生态制剂奠定了基础。

地衣芽孢杆菌A13重组表达黑曲霉植酸酶phyA基因的研究

将黑曲霉Z6植酸酶phyA基因置于芽孢杆菌强启动子F1下,与大肠-芽孢杆菌穿梭表达载体pHY300PLK连接,重组质粒pHY300-F1-phyA电击转化地衣芽孢杆菌A13。筛选阳性克隆,获得重组菌株A13-F1-phyA,PCR扩增及酶切验证表明植酸酶基因已转入地衣芽孢杆菌。SDS-PAGE分析和表达产物的酶活性研究证明,重组菌株中植酸酶得到了有效分泌和表达。

黑曲霉Z6植酸酶基因phyA的克隆及表达

目的:克隆植酸酶基因phyA,构建毕赤酵母表达载体,转化毕赤酵母,并对重组工程菌的表达产物进行初步酶学性质研究。方法:以植酸酶高产菌株─黑曲霉Z6染色体DNA为模板,PCR扩增得到植酸酶基因phyA,序列鉴定后连接到毕赤酵母穿梭载体pPIC9K上,构建重组质粒pPIC9K-phyA,电击转化毕赤酵母KM71,筛选得到重组转化子。对重组工程菌表达产物进行SDS-PAGE分析和酶活性研究。结果:phyA序列分析表明该基因具有典型的植酸酶活性位点保守序列ArgHisGlyAlaArgTyrPro,与NC-BI已发表的植酸酶基因同源性较高,达到94%以上。该序列已提交GenBank,序列号为DQ318022。重组工程菌KM71-phyA7的PCR扩增证实了植酸酶基因已整合到酵母基因组中,植酸酶能有效分泌和表达,粗酶液酶活可达875U/mL。结论:植酸酶基因phyA在毕赤酵母中成功表达,为今后的定向改组奠定了基础。

植酸酶phyA基因的密码子优化及其在大豆中的表达

植酸是植物源食品中的主要抗营养成分,降低植酸含量可有效提高大豆的营养利用率。本文根据大豆密码子使用偏好性,对无花果曲霉植酸酶phyA基因进行密码子优化,人工合成了适合在大豆中表达的phyA(b)基因。以p CAMBIA3301为骨架,构建由大豆凝集素基因启动子和信号肽序列调控的植物表达载体pCBPS-phyA(b)。用农杆菌介导法遗传转化吉林35大豆子叶节。PCR检测表明目的基因已初步整合至大豆基因组中;bar试纸条表明所有阳性植株中均能检测到bar基因的蛋白产物;除草剂叶片涂抹显示野生型的叶片出现黄化或枯萎现象,而转基因植株叶片表现正常,具除草剂抗性;以半定量RT-PCR共筛选到13株转phyA和19株转phyA(b)阳性转基因大豆植株。通过对转基因大豆T_3种子中植酸酶活性、无机磷和植酸磷含量等检测,证明人工基因phyA(b)比phyA在大豆种子中所表达的植酸酶具有更高的活性,说明密码子优化有利于提高外源基因的表达。

转phyA基因棉花纯合株系筛选及其对土壤有机磷的利用能力

为了获得转植酸酶基因(phyA)棉花高代纯合株系并验证其利用土壤中有机态磷的能力,对实验室获得的转phyA基因T4代材料进行了PCR筛选,在水培条件下研究了纯合株系植株根际分泌的植酸酶活性,并在田间进行了植株磷含量和棉花产量性状分析。结果表明,在PCR筛选的4个株系中,有2个株系为纯合株系,其后代均为PCR阳性植株。在以植酸盐为唯一磷源条件下,高表达phyA的转基因株系的植酸酶活性较野生型增加了1.5倍,不同生育时期转基因株系植株叶片磷含量中L6株系增加最多,苗期、现蕾期、花铃期和吐絮期分别增加了4.5%,5.95%,5.45%和8.73%。

人工合成的黑曲霉NRRL3135菌株植酸酶基因在毕赤酵母系统中的高效表达

本文以黑曲霉 (Aspergillusniger)NRRL3135菌株植酸酶基因为对象 ,通过基因人工合成的方法去除了该基因的内含子与信号肽编码序列 ,换用在毕赤酵母 (Pichiapastoris)中使用频率较高的密码子以优化其表达。该人工合成植酸酶基因 (PhyA as)以N端融合的方式正确插入到毕赤酵母表达载体pPICZαA。通过电击将重组表达载体整合入酵母染色体DNA中得到重组转化子。SDS PAGE结果与表达产物酶学性质研究表明植酸酶得到分泌表达 ,且与天然产物性质基本一致。筛选得若干株高产基因工程菌 ,其中SPAN Ⅲ菌株达到了在摇床培养条件下 ,每毫升发酵液产生 16 5 0 0 0u植酸酶的水平 。

黑曲霉N14植酸酶基因在巴斯德毕赤酵母中的高效表达

从黑曲霉N14基因组DNA中扩增出植酸酶phyA基因表达片段 ,并将其克隆到pMD18 T载体中。以此片段构建了pPIC9K phyA重组表达载体 ,目的片段以正确的阅读框架插入到pPIC9K的多克隆位点EcoRⅠ和NotⅠ之间。重组表达载体经XbaⅠ线性化处理 ,电击转化毕赤酵母 ,经G4 18抗性筛选、酶活性测定、PCR鉴定和SDS PAGE分析 ,获得了两株产酶活性分别为 14 395 8 3u mL发酵液 (PP N14 2 2 )和 14 890 8 3u mL发酵液 (PP N14 4 4 )的高产工程菌 ,其酶活性分别是出发菌株酶活性 (4 2 2u mL)的 341 13倍和 35 2 86倍 ,重组酵母具有很好的遗传稳定性。重组植酸酶在pH值 2 5～ 3 0和 5 0～ 5 5时酶活性最高 ,且在pH4 5～ 6 5之间均有相当高的酶活性 ,最适作用温度为5 5℃。

F43Y及I354M,L358F定点突变对植酸酶热稳定性及酶活性的改善

对重组酵母PPNPm8的植酸酶phyAm基因进行PCR介导的定点突变,即将植酸酶43位的苯丙氨酸替换为酪氨酸(F43Y),将其354、358位的异亮氨酸、亮氨酸分别替换为甲硫氨酸和苯丙氨酸(I354M,L358F),得到了2个突变体PPNPm-1(F43Y)及PPNPm-2(I354M,L358F).含突变基因的重组表达载体pPIC9kphyAm-1,pPIC9kphyAm-2在毕赤酵母GS115中表达,对表达产物进行酶活性测定及热稳定性检测.结果表明:突变体PPNPm-1最适反应温度比未突变体PPNPm8上升了3℃,75℃处理10min,热稳定性提高15%,比活力提高11%;PPNPm-2最适反应温度未改变,热稳定性比PPNPm8仅提高3%,比活力降低6.5%.对突变前后的植酸酶空间结构进行比较预测,发现突变氨基酸Tyr43与空间位置相邻的Asn416之间形成氢键,增强了酶的热稳定性.

植酸酶产生菌黑曲霉N14的诱变选育及其基因分析

以植酸酶产生菌黑曲霉03214为出发菌株,经紫外线和亚硝基胍诱变,获得了产酶活性较出发菌株提高了22.3%,达422IU/ml发酵液的突变菌株黑曲霉N14,其最适pH值为2.5,最适温度为50℃。通过对黑曲霉N14植酸酶phyA基因进行PCR扩增,获得了一条长约1.5kb的特异性产物。以pMD18 T为载体,构建了含有目的基因片段的重组质粒。DNA序列测定表明,目的基因片段含有植酸酶phyA基因的完整序列(GenBankAccession:AY426977),phyA基因全长1506bp,其中包含一段长102bp的内含子,编码467个氨基酸,有10个潜在的糖基化位点,5'端有一编码19个氨基酸的信号肽序列。实验结果为植酸酶基因工程菌的构建奠定了基础。

产植酸酶黑曲霉菌株S8的基因扩增与鉴定

本文主要报道了用 3种不同方法从S8黑曲霉菌丝体中提取基因组DNA ,最适方法是经改进的Vitagene试剂盒法。PCR扩增效果最好的是设计时没有去掉phyA基因内含子的引物 ,获得的特异性PCR产物长约 1.5kb。同时对PCR反应体系进行了优化。对扩增出的目的片段用 3种不同方法进行纯化回收 ,结果是PCRFragmentRe coveryKit法回收效果最好 ,其产量可达到约 10ng/ μL。根据已报道的植酸酶phyA基因序列酶切位点 ,对回收的目的片段进行酶切鉴定 ,该基因能被BamHⅠ、SalⅠ酶切 ,不能被HindⅢ、XbalⅠ、KPnⅠ酶切 ,与已知的phyA基因酶切图谱基本一致 。

黑曲霉3928植酸酶phy基因的克隆及全序列分析

根据GenBank中已注册的黑曲霉基因序列设计了1对引物,通过PCR方法将黑曲霉phy A全基因进行扩增,获得了1条长约1.5 kb的特异性PCR产物,在PMD18 T载体中克隆了黑曲霉3928植酸酶phy A全基因,筛选到2个重组菌落(1#和2#),并进行了全序列测定。序列分析结果表明:2个重组质粒的测序结果完全一致;克隆的片段中含有完整的phy A基因序列,全长1 506 bp,其中含有一段长102 bp的内含子;phyA基因全序列编码467个氨基酸,信号肽位于基因的5′端,长度为19个氨基酸;碱基序列与GenBank中报道的AY513749的同源性为98.87%,编码的氨基酸序列的同源性为97.21%。

植酸酶基因在毕赤酵母中表达及表达酶性质研究

PCR扩增无花果曲霉 As3 .3 2 4的植酸酶基因 phy A ,测序分析表明 ,phy A 全长1 5 1 5 bp,其中 1 1 1个核苷酸为内含子序列 ,共编码 467个氨基酸 ,N端的 1 9个氨基酸为信号肽 ,序列中存在 1 0个潜在的 N-糖基化位点 .构建 phy A 的酵母转化载体 p PIC9K/phy A ,电击法转化毕赤酵母 GS1 1 5 ,获得植酸酶基因重组酵母菌 GS1 1 5 /phy A .其发酵酶活性比 As3 .3 2 4提高了 3 3倍 .GS1 1 5 /phy A 植酸酶作用 p H有两个峰值 ,分别为 2 .5和4.5 ,最适作用温度为 60℃ .与 As3 .3 2 4相比 ,重组毕赤酵母 GS1 1 5 /phy A 植酸酶的热稳定性有显著提高 .

农杆菌介导的植酸酶基因转化棉花的研究

为建立一种转化效率高、稳定性好的棉花农杆菌遗传转化体系,以优良的陆地棉品种晋棉14、陕724为受体材料,利用农杆菌介导的方法,将含有根特异性表达启动子的植酸酶基因(PhyA)转入供试品种的胚性愈伤中;对获得的再生植株进行PCR检测,证明PhyA已经被插入到棉花基因组中,晋棉14和陕724的转化效率分别为33%和8.3%;此外,还对影响农杆菌侵染棉花胚性愈伤转化效率的因素,如卡那霉素浓度、胚性愈伤组织生长状态、受体材料的基因型等进行了较为系统的比较研究。

植酸酶植物基因工程载体的构建

通过PCR方法从植酸酶基因克隆载体PUC18/ phyAI中扩增出Aspergillus.ficuumAS3 .32 4植酸酶 (phyA)基因 ,经酶切连接后克隆到植物中间载体pBI12 1,获得含AS3 .32 4植酸酶基因的质粒pBI12 1/ phyAⅡ。用冻融法将pBI12 1/ phyAⅡ导入表达载体根癌农杆菌LBA44 0 4中。经过抗生素筛选、PCR检测 ,证明得到了正确表达载体———LBA44 0 4/pBI12 1/ phyAⅡ 。