辣椒CaDXS和CaPDS基因沉默的表型比较

【目的】沉默辣椒CaDXS和CaPDS基因,比较分析两者白化表型的差异,寻找新的辣椒沉默标记基因。【方法】利用双酶切克隆技术构建CaDXS和CaPDS基因的沉默载体;通过农杆菌介导转化侵染辣椒,观察辣椒的沉默表型;采用实时荧光定量PCR技术检测CaDXS和CaPDS基因的沉默效率。【结果】农杆菌浸润21 d后,沉默CaDXS基因的辣椒叶片出现褪绿症状,沉默CaPDS基因的辣椒叶片出现白化。农杆菌浸润30 d后,沉默CaDXS基因的辣椒叶片出现较为明显的白化;沉默CaPDS基因的辣椒叶片白化程度加剧,新叶近乎白化。与CaDXS基因相比,沉默CaPDS基因导致的辣椒白化表型更明显和高效。沉默组辣椒叶片中CaDXS和CaPDS基因的表达量均显著降低(P<0.05),沉默效率分别为86.80%和93.08%,表明辣椒CaDXS和CaPDS基因被成功沉默。【结论】CaDXS基因可以作为辣椒的沉默标记基因,但沉默CaPDS基因的辣椒白化表型出现更早且明显,因此,CaPDS基因比CaDXS基因更适合作为辣椒沉默标记基因。

魔芋PDS基因VIGS载体的构建及其功能鉴定

本文采用PCR技术从魔芋中克隆了番茄红素脱氢酶(PDS)基因部分序列,该片段长度450 bp,分析表明该基因片段与烟草中PDS序列同源性为77%。经过双酶切构建了p TRV-PDS的VIGS载体,转入农杆菌浸染魔芋,感染的组培苗魔芋植株叶片出现白化表型,定量PCR结果表明魔芋PDS基因的mRNA丰度出现下调且下调了10%。

超表达牛奶子EutPDS提高番茄果实番茄红素含量

【目的】牛奶子果实中富含番茄红素,八氢番茄红素脱氢酶(PDS)是番茄红素生物合成上游的重要酶。特异性超表达牛奶子Eut PDS基因(Gen Bank登录号:GQ254067),以期提高番茄果实中的番茄红素含量。【方法】通过RT-PCR方法从牛奶子果实中分离EutPDS基因cDNA及基因组全长,Southern杂交分析基因的拷贝数,专用软件分析此基因及蛋白结构。采用番茄2A11启动子构建果实特异性超表达载体,转化根瘤农杆菌GV3101后,借助农杆菌介导的叶盘法转化至‘中蔬四号’番茄。半定量RT-PCR检测转基因植株果实EutPDS基因的表达,高效液相色谱仪、实时定量PCR分别用于分析转基因番茄果实主要类胡萝卜素组分含量和内源类胡萝卜素代谢相关基因表达的变化。【结果】从牛奶子中克隆的EutPDS基因长度为1 920 bp,含有1 749 bp ORF。其基因组序列无内含子,单拷贝。EutPDS编码1个582个氨基酸的蛋白,该蛋白与其他植物PDS有很高的同源性,具有典型的二核苷酸结合域、类胡萝卜素结合域。采用农杆菌介导方法转化番茄叶盘,PCR检测,潮霉素筛选,成功获得了2个EutPDS转基因番茄株系,其果实颜色较对照更红。半定量分析显示外源EutPDS基因在转基因番茄果实中超表达,实时定量PCR分析表明番茄红素生物合成上游2个内源基因Sl PSY和Sl ZDS受影响显著上调,同时1个下游基因Sl LCY-e的表达则显著下调,使得转基因番茄果实中番茄红素含量为野生型的2倍,但β-胡萝卜素含量无显著变化。【结论】在番茄果实中特异性超表达牛奶子EutPDS基因可有效促进番茄果实中番茄红素的合成和积累。

利用VIGS技术在本氏烟中沉默枸杞PDS同源基因的研究

【目的】本项研究旨在通过建立一个异源VIGS体系,为枸杞重要性状相关基因的功能鉴定提供前期信息。【方法】从枸杞叶片中克隆获得409 bp长的八氢番茄红素脱饱和酶基因(phytoene desaturase,PDS)的编码区片段,构建入基于烟草脆裂病毒的VIGS空载体中,通过农杆菌介导的侵润接种,将重组的病毒沉默载体pTRV2-PDS转入本氏烟中。【结果】本氏烟幼苗被侵染接种后,沉默处理植株的叶片呈现整叶白化的表型,而阴性对照植株叶片一直未出现变白的症状,qRT-PCR检测表明,接种17 d后,与阴性对照植株相比,沉默处理植株PDS基因的表达显著地被抑制(P<0.05),说明枸杞PDS基因的同源基因在本氏烟中得到了有效沉默。【结论】该VIGS体系的构建,可用于对枸杞部分基因功能的快速初步鉴定和筛选,旨在提高枸杞基因功能研究的效率。

病毒诱导的基因沉默技术实验教学设计和实践

病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术是近年发展起来研究植物基因功能的新方法。利用含有目的基因片段的病毒载体侵染植物,导致植物体内相应的功能基因表达受到抑制成为沉默基因,相应功能缺失,从而推测目的基因的功能。该文克隆了烟草番茄红素脱氢酶(PDS)基因片段,插入到烟草脆裂病毒载体(TRV)中,构建了pTRV-PDS的VIGS载体,转入农杆菌侵染烟草后成功沉默了PDS基因,使烟草叶片出现白化表型,成功建立了烟草VIGS体系。将VIGS这个当前生物学研究热点引入教学实验中,改革更新实验教学内容,有益于学生扩展科研思维。

TRV介导的大豆基因瞬时沉默体系的建立

【目的】病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)技术已在植物基因功能研究领域得到广泛应用。建立以TRV为载体介导的大豆基因瞬时沉默体系,为将烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)介导的基因沉默技术在大豆与大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus,SMV)互作体系中对大豆基因功能进行研究提供基础。【方法】从大豆品种冀豆7号(J7)叶片中特异性扩增八氢番茄红素脱氢酶基因(Gm PDS)的部分片段,并将该基因片段插入质粒p TRV﹕RNA2中;向J7的第一位真叶注射携带有TRV或TRV﹕Gm PDS的农杆菌,注射后对上部未接种病毒的叶片进行表型观察,并通过半定量RT-PCR检测Gm PDS的表达量。为探讨接种TRV是否影响大豆对SMV的抗性表现,在大豆第一片真叶上预接种TRV病毒后10 d,再分别接种SMV株系N3和SC-8,以单独接种N3或SC-8作为对照。待接种SMV后第5天观察未接种的上位叶表型并检测SMV的外壳蛋白基因CP。【结果】大豆叶片注射携带有TRV﹕Gm PDS的农杆菌后25 d,上部未接种病毒的叶片出现了白化现象,通过半定量RT-PCR分析,发生白化的植株中Gm PDS的表达量明显降低。在此基础上,向大豆叶片预注射携带有TRV的农杆菌后再接种SMV,SMV株系N3和SC-8与J7分别组成不亲和与亲和组合。发现J7第一片真叶上预接种TRV后再接种SMV株系N3,与单独接种N3对上位叶的影响在表型上表现一致,对未接种的上位叶片进行病毒外壳蛋白基因CP检测,发现J7单独接种N3以及预接种TRV后再接种N3的上位叶片上均未能检测到CP表达。而J7单独接种SMV株系SC-8,以及预接种TRV后再接种SC-8均在上位叶上能够检测到CP。说明在J7上预接种TRV不影响J7对SMV的抗性。在感病品种南农1138-2上也获得了相似结果。【结论】建立了以TRV为载体介导的大豆基因瞬时沉默体系,并证明在大豆上先接种TRV不改变大豆对SMV的抗性表现。

辣椒病毒诱导基因沉默体系的构建

采用RT-PCR方法克隆辣椒八氢番茄红素脱氢酶(PDS)基因部分序列,并构建病毒诱导基因沉默(VIGS)载体pYL156-PDS,经农杆菌介导侵染辣椒叶片,采用表型观察、半定量RT-PCR方法评价构建的VIGS体系的沉默效果.结果表明,辣椒新生叶片呈现明显的光漂白现象,且叶片内源PDS基因表达量明显低于对照.研究证明,辣椒VIGS体系已被成功构建,为规模化验证辣椒基因功能提供了技术平台.

运用农杆菌介导的瞬时表达体系研究PDS基因沉默(英文)

农杆菌介导的瞬时表达体系是一个研究整株植物基因沉默的快速实用系统.本文介绍了运用该系统研究马铃薯X病毒诱导烟草(Nicotiana benthamiana)八氢番茄红素脱氢酶(phytoene desaturase,PDS)基因的沉默问题.实验结果表明:携带有与PDS基因同源的409个碱基大小的cDNA片段的重组的马铃薯X病毒载体抑制了内源的PDS基因的表达.

芝麻八氢番茄红素脱氢酶基因SiPDS的克隆与序列分析

来自芝麻的八氢番茄红素脱氢酶基因(phytoene desaturase gene,PDS)的分离鉴定尚未见报道。本研究根据已报道植物PDS基因的氨基酸保守区,设计简并引物,扩增出编码芝麻新蔡选抗PDS基因c DNA的中间片段。利用电子克隆技术,从芝麻EST数据库中比对得到一条高度同源的序列,并通过RT-PCR方法,从新蔡选抗成功克隆了八氢番茄红素脱氢酶基因的c DNA,命名为Si PDS(Gen Bank登录号:KJ191121)。c DNA序列全长2 273 bp,开放阅读框长度为1 743 bp,编码580个氨基酸。根据克隆获得的全长c DNA序列设计引物,从新蔡选抗DNA中克隆获得Si PDS基因的全长DNA,长度为5 592 bp,转录区包括14个外显子和13个内含子。序列分析表明,Si PDS与其他植物的PDS蛋白序列高度相似;系统进化树分析表明,芝麻Si PDS与黄芩的亲缘关系最近。Si PDS基因可以用作植物病毒诱导的基因沉默载体的内源检测基因,在利用基因工程技术改良芝麻农艺性状方面具有较大的应用价值。

含芳氧乙酰基和间-三氟甲基苯基的双酰胺化合物的合成及其除草活性

通过组合不同除草作用机制的活性基团,采用芳氧乙酸为酸组分的Ugi四组分反应合成了一系列芳氧乙酰基和间三氟甲基苯基片段的双酰胺化合物3a^3v,采用IR、1H NMR、EI-MS和元素分析等技术手段对其结构进行了表征。温室盆栽测试结果表明,部分目标化合物对油菜、反枝苋、稗草和马唐表现出中等至良好的除草活性,如化合物3r在温室盆栽时,在1.5 kg/ha剂量下,在苗前处理时对反枝苋和马唐显示出100%的抑制活性;在苗后处理时对马唐显示出100%的抑制活性。初步探讨了目标化合物的构效关系。

基于三角梅的病毒诱导基因沉默体系的建立与优化

三角梅是紫茉莉科灌木,具有较高的观赏价值,是研究花色叶色调控的理想材料。建立快速高效的基因验证体系,是三角梅基因功能研究的关键。以三角梅‘金心双色’品种为材料,选用八氢番茄红素脱氢酶基因(PDS)为指示基因,探索不同接种部位和基因片段长度对烟草脆裂病毒(TRV)诱导三角梅叶片内源PDS mRNA沉默效果的影响,建立适用于三角梅的病毒诱导基因沉默体系(VIGS)。结果表明,摩擦注射嫩叶法相比顶端嫩茎沉默效果更明显;基因沉默片段长度在336 bp和457 bp均可诱导PDS基因沉默,后者效果更加明显。初步构建了三角梅VIGS体系,为后续基因功能研究提供了技术参考。

三角褐指藻八氢番茄红素脱氢酶1-2基因启动子克隆和表达分析

八氢番茄红素脱氢酶(phytoene desaturase,PDS)是类胡萝卜素合成的关键酶,在光合生物的类胡萝卜素代谢调控中发挥了重要的作用。本研究根据三角褐指藻基因组数据库,克隆三角褐指藻PDS1和PDS2基因启动子序列,采用启动子缺失技术研究启动子活性,利用Plant CARE预测三角褐指藻PDS1和PDS2启动子顺式作用元件,采用qRT-PCR技术检测三角褐指藻PDS1和PDS2基因在不同胁迫下的相对表达量。结果表明,三角褐指藻PDS1和PDS2基因启动子全长分别为2000 bp和920 bp,不同长度的5′端缺失后启动子均能驱动绿色荧光蛋白表达,具有较强启动子活性。Plant CARE分析结果表明,三角褐指藻PDS1和PDS2基因启动子中均含有与光照和植物激素响应有关的顺式作用元件。光照和植物激素胁迫处理结果表明,三角褐指藻PDS1基因受光合诱导因子(photosynthetic induction factor,PIF)的诱导表达,但在其他因子处理下表达均显著下降(P<0.05)或无显著性差异。三角褐指藻PDS2基因在PIF、红光、茉莉酸甲酯、乙酰水杨酸和脱落酸胁迫下均表达上调(P<0.05),在光合作用抑制剂二氯苯基二甲脲(dichlorophenyl dimethylurea,DCMU)、黄光和蓝光胁迫下显著下调(P<0.05)。三角褐指藻PDS2基因在不同处理下的基因表达和岩藻黄素含量呈显著的正相关关系(r=0.8551,P<0.01),说明PDS2基因可能是三角褐指藻岩藻黄素合成的关键基因。本研究揭示了三角褐指藻的PDS基因参与光系统和植物激素胁迫应答的新功能,为进一步研究岩藻黄素调控机制提供了一定的理论基础。

在中国大豆品种上创建ALSV诱导的基因沉默体系

【目的】在中国大豆品种上建立以苹果潜隐球形病毒(apple latent spherical virus,ALSV)为载体的基因沉默体系,为中国大豆品种的基因功能和遗传育种提供一种简便、省时、易操作的技术体系。【方法】构建以农杆菌介导接种的ALSV病毒侵染性克隆载体。从大豆品种威廉姆斯82(Williams 82)中特异扩增327 bp的八氢番茄红素脱氢酶(GmPDS)基因cDNA片段,插入病毒载体pALSV2。通过农杆菌浸润法将病毒载体导入模式植物本氏烟(Nicotiana benthamiana),17 d后富集病毒粒子,摩擦接种大豆第一轮真叶,以接种病毒空载作为对照组,持续观察测试大豆植株系统叶表型,并结合逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)或荧光定量PCR(qRT-PCR)检测ALSV衣壳蛋白基因(CP)和GmPDS的表达水平。【结果】ALSV﹕GmPDS接种大豆品种威廉姆斯82和南农1138-2,20 d后,前者系统叶未见白化表型,而后者系统叶出现明显的白化表型;qRT-PCR检测结果表明,发生白化的南农1138-2植株中GmPDS的表达水平显著降低,未出现白化表型的威廉姆斯82中GmPDS的表达水平没有出现显著变化。在此基础上,采用相同的方法,测试了ALSV在其他9种大豆品种中诱导GmPDS的沉默效率,发现在南农47、安豆203、祥斗4号、中黄13、山宁29、齐黄34等大豆品种上接种ALSV﹕GmPDS后植株系统叶均产生白化表型,而菏豆12、中黄311和山宁16等3个品种的GmPDS均不能诱导有效沉默。【结论】构建了农杆菌介导的ALSV病毒载体,利用本氏烟扩繁富集ALSV病毒,将提纯的病毒粒体摩擦接种大豆真叶,在多个中国大豆品种上成功建立了基因沉默体系。

利用Ugi反应合成2-{N-(3-三氟甲基苯基)-[3-(三氟甲基)苯甲酰、2-(取代苯氧)丙酰、2-(4,6-二甲氧基-嘧啶-2-氧基)苯甲酰]-氨基}-取代苯乙酰环己胺及其除草活性评价

为了寻找新型高活性的除草剂先导化合物,采用活性亚结构连接法,利用Ugi反应将3-三氟甲基苯甲酰基、2-(取代苯氧)丙酰基和2-(4,6-二甲氧基嘧啶-2-氧基)苯甲酰基等除草活性结构片段与3-三氟甲基苯基引入到同一分子中,合成了一系列2-{N-(3-三氟甲基苯基)-[3-(三氟甲基)苯甲酰、2-(取代苯氧)丙酰、2-(4,6-二甲氧基嘧啶-2-氧基)苯甲酰]-氨基}-取代苯乙酰环己胺3a^3i,采用IR,1H NMR,EI-MS和元素分析对其结构进行了表征.初步的除草活性测试结果表明:部分化合物在100 mg/L浓度下对油菜显示出中等至良好的除草活性.温室盆栽测试结果显示部分化合物在1.5kg/ha剂量下,在苗前处理时对油菜、反枝苋、稗草和马唐具有良好的除草活性.

几种除草剂靶酶及其抑制剂的研究进展

根据作用靶标对除草剂进行分类,对于新型除草剂的设计能够起到很大的帮助。迄今为止,人们已发现除草剂的不同作用位点近30种,涉及到50余种不同化学结构的化合物。文中介绍了谷氨酰胺合成酶(GS)、咪唑甘油磷酯脱水酶(IGPD)、乙酰辅酶A羧化酶(ACCace)、八氢番茄红素脱氢酶(PDS)及其各自抑制剂的研究进展。分别从酶的生理功能、酶学特征、抑制剂作用机理、抑制剂的研究、抗性等方面进行了不同程度的阐述。