piRNA hsa_piR_016187调控椎管内神经鞘瘤细胞增殖的实验研究

目的:探究PIWI相互作用RNA(PIWI-interacting RNA,piRNA)hsa_piR_016187对椎管内神经鞘瘤细胞增殖的调控作用及作用机制。方法:利用piRNA测序分析神经鞘瘤组织和对应的肿瘤旁正常组织中piRNA的表达情况,利用实时荧光定量PCR检测piRNA的表达,利用CCK-8检测和克隆增殖实验检测piRNA hsa_piR_016187对神经鞘瘤增殖的影响,利用双荧光素酶报告基因和Western blot检测piRNA hsa_piR_016187对胰岛素样生长因子2表达的调控作用。结果:piRNA hsa_piR_016187在神经鞘瘤组织中表达降低,piRNA hsa_piR_016187可以抑制神经鞘瘤细胞的增殖,双荧光素酶报告基因结果表明piRNA hsa_piR_016187可以和IGF23’-UTR区结合,Western blot检测显示过表达piRNA hsa_piR_016187抑制IGF2的表达,抑制piRNA hsa_piR_016187的表达促进IGF2的表达。结论:piRNA hsa_piR_016187通过调控IGF2的表达抑制神经鞘瘤细胞的增殖。

缺氧后处理通过piRNA-005854调控衰老心肌细胞自噬发挥保护心肌作用

背景:缺血后处理是减轻缺血再灌注损伤的有效方式之一,近年来被越来越广泛地应用于临床实践,但其具体分子机制还有待研究。目的:探讨piRNA-005854在衰老心肌细胞缺氧后处理中的作用及机制。方法:体外给予心肌细胞8 mg/mL D-半乳糖9 d诱导其衰老,β-半乳糖苷酶染色观察心肌细胞的衰老情况;衰老后细胞给予缺氧/复氧处理和缺氧后处理,ELISA检测心肌损伤标志物肌酸激酶同工酶MB以及乳酸脱氢酶水平;Western blot检测衰老心肌细胞中自噬相关蛋白LC3Ⅱ、p62和ULK1及其磷酸化ULK1的表达;qRT-PCR检测piRNA-005854的表达水平;进一步用piRNA-005854 inhibitor及piRNA-005854 mimics转染衰老心肌细胞并进行缺氧后处理,Western blot检测LC3Ⅱ、p62和ULK1及其磷酸化ULK1的表达。结果与结论:①D-半乳糖诱导9 d后心肌细胞出现明显衰老;②与正常氧组比较,缺氧/复氧组肌酸激酶同工酶MB以及乳酸脱氢酶水平增加(P<0.01);LC3Ⅱ/Ⅰ表达升高、p62表达降低、ULK1磷酸化水平升高、piRNA-005854表达升高(P<0.01);③与缺氧/复氧组比较,缺氧后处理组肌酸激酶同工酶MB以及乳酸脱氢酶水平明显减少(P<0.01);LC3Ⅱ/Ⅰ表达明显降低(P<0.05)、p62表达升高(P<0.01)、ULK1磷酸化水平降低(P<0.05)、piRNA-005854表达降低(P<0.01);④转染piRNA-005854 inhibitor后,LC3Ⅱ/Ⅰ表达降低(P<0.01),p62表达明显升高(P<0.05),ULK1磷酸化水平明显降低(P<0.01);转染piRNA-005854 mimics后,LC3Ⅱ/Ⅰ表达显著升高,p62表达降低,ULK1磷酸化水平明显增加(P<0.01);⑤结果表明,piRNA-005854介导的ULK1依赖性自噬水平降低是衰老心肌细胞缺氧后处理发挥保护作用的可能机制。

piRNA及其生成相关基因在睾丸发育过程中的表达特征分析

【目的】以不同发育时间点ICR小鼠为研究对象,旨在探究piRNA及其相关基因在小鼠睾丸中的表达规律,并为研究piRNA在睾丸发育和精子生成的相关调控机制提供理论依据。【方法】通过HE染色、qRT-PCR等技术手段,分析不同发育日龄小鼠睾丸组织的表型差异及piRNA和piRNA生成相关基因的表达水平,同时研究与piRNA相关的调控因子在睾丸发育过程中的动态变化和相关性分析。【结果】小鼠睾丸组织中的piRNA表达量呈现出明显的时序性变化,随着发育日龄的增长而逐渐增加,表明piRNA在小鼠睾丸发育过程中发挥着重要的调控作用。进一步分析发现,一些与piRNA相关的基因在不同发育阶段表达水平存在显著差异,提示这些基因可能参与了小鼠睾丸发育和精子生成的调控网络。【结论】揭示了piRNA在小鼠睾丸中的表达规律及其潜在的调控机制,为理解睾丸发育和精子生成过程中的分子调控提供了新的理论基础。

piRNA DQ725559通过抑制心肌细胞铁死亡通路抗心肌缺血再灌注损伤的作用

为探究心肌缺血再灌注损伤(Ischemia-reperfusion Injury,IRI)与铁死亡关系,寻找相关Piwi相互作用RNA(Piwi-interacting RNA,piRNA),利用小鼠乳鼠原代心肌细胞缺氧/复氧(Hypoxia/Reoxygenation,H/R)构建心肌细胞IRI模型,通过细胞生存率反映诱导铁死亡最佳H/R时间点,筛选铁死亡相关piRNA,检测铁死亡相关指标变化。研究结果显示,缺氧18 h/复氧6 h后,心肌细胞铁死亡和IRI呈现关联,抑制DQ725559的表达会加重心肌细胞铁死亡和IRI,过表达DQ725559会减轻心肌细胞铁死亡和IRI。研究结果表明,DQ725559可通过调节心肌细胞铁死亡通路发挥IRI调控作用,过表达DQ725559可成为RNA治疗心血管疾病新策略。

piRNA在肝脏相关疾病中的研究进展

piRNA是一类平均长度为24~31个核苷酸的内源性非编码RNA,在多种人类组织中特异性表达,与PIWI蛋白结合形成piRNA/PIWI复合物,在多个生理病理过程中发挥重要的调节作用。本文就piRNA生物结构、生物学功能及在肝脏相关疾病中的作用进行综述,为挖掘piRNA的潜在价值,并将piRNA应用于该类疾病的早期识别、早期诊断及治疗提供参考。

piRNA通路在生精过程中的作用

piRNA是一类特异性与Argonuat蛋白家族中的PIWI蛋白相互结合形成piRNA沉默复合体(piRNA-induced silencing complex,piRISC)而在生物体内发挥重要作用的非编码小RNA,主要作用于生殖系统。piRNA通路不仅通过抑制转座子,还通过泛素化降解、调控mRNA表达、基因甲基化修饰等方式来发挥在生精过程中的特定作用。本文拟对piRNA通路在生精过程中的作用进行综述。

piRNA通路与精子发生的研究进展

与PIWI蛋白相互作用的RNA(piRNA)是一类动物生殖系细胞特异性表达的小分子非编码RNA。本文从piRNA分子、PIWI蛋白及其他相关蛋白3个方面系统概括了piRNA通路。发现piRNA通路不仅通过抑制转座子机制,还可以通过调控翻译、生殖系干细胞的维护、RNA的降解、基因防御等方面来影响精子发生。因此对piRNA通路在精子发生中的最新研究进展进行了综述。

piRNA-DQ723301通过靶向调控Smad2对非酒精性脂肪肝小鼠肝星状细胞活化及功能的影响

目的非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)目前已逐渐成为威胁人类生活健康的最常见的肝病之一,然而其发病机制尚未完全阐释清楚,近期有研究表明在非酒精性脂肪肝病存在异常表达的piRNAs,其中piRNA-DQ723301可能通过靶向调控Smad2参与非酒精性脂肪肝病的发生发展,但其靶向作用及具体机制尚未被完全阐明。因此,本实验的目的旨在研究piRNA-DQ723301与Smad2是否存在靶向调控,从而参与NAFLD的发生发展,以不断完善piRNA在NAFLD发病机制中的作用奠定理论基础。方法1.设计含有piRNA-DQ723301结合位点的Smad23′-UTR PCR引物,通过双荧光素酶实验分析得出piRNA-DQ723301对Smad2的靶向调控作用。2.通过CCK8法检测,比较转染不同浓度piRNA-DQ723301模拟物及抑制剂48h后各组细胞的活力,通过比较得出较合适的浓度。3.Smad2 mRNA及蛋白、piRNA-DQ723301的表达情况通过Western-blot法、实时荧光定量PCR分析。并观察piRNA-DQ723301对非酒精性脂肪肝纤维化发病关键因子的影响。结果1.将构建的阴性对照序列、质粒、模拟物共同转染至293T细胞,针对荧光素酶活性进行检测。表明与对照组相比,piRNA-DQ723301以野生型质粒为载体时,酶活性能受到抑制;而以突变型质粒为载体时,荧光素酶酶活性则无明显改变,且piRNA-DQ723301类似物野生质粒组荧光素酶活性比piRNA-DQ723301类似物突变型质粒组组明显减少,差异有统计学意义(P<0.01)。2.CCK8法结果表明,小鼠原代肝星状细胞活力在转染100 nM、150 nM的模拟物、抑制剂后分别呈现出下降、增强趋势,转染50 nM的模拟物、抑制剂及各浓度的对照序列则基本不变。3.相较于未转染组,转染组piRNA-DQ723301表达量、Smad2 mRNA表达量、α-SMA mRNA在NC组、Mimic组、Inhibitor组分别呈现出基本不变、显著增高(P<0.001)、明显降低(P<0.001)的变化趋势。4.相较于未转染组,各转染组Smad2蛋白的表达量在NC组、Mimic组、Inhibitor组的变化趋势分别为基本不变、显著降低(P<0.001)、明显升高(P<0.001);Piwi蛋白的表达量在NC组、Mimic组、Inhibitor组的变化趋势分别为基本不变、Piwil3基本不变及Piwil1、Piwil2、Piwil4显著增高(P<0.01)、Piwil3基本不变及Piwil1、Piwil2、Piwil4降低(P<0.05)。与Inhibitor组相比,Mimic组Piwi表达量增加(P<0.01),Smad2表达量降低(P<0.001)。5.与未转染组比较,TGF-β1、α-SMA蛋白表达量在NC组、Mimic组的变化趋势分别为基本不变、显著降低(P<0.001),Inhibitor组则显著上升(P<0.001)。结论1.piRNA-DQ723301针对Smad2的表达具有靶向调节作用,能够抑制其表达;2.piRNA-DQ723301可靶向调控Smad2抑制肝星状细胞活力及功能;3.利用piRNA-DQ723301的靶向调控作用或可对肝纤维化的发生发展产生抑制甚至逆转作用。

线虫体内新piRNA研究

PIWI-interacting RNAs(piRNA)是一类內源性小RNA,负责抵御转座子和转基因对基因组的入侵.已发现1.6万多种piRNA,在piRNA上游存在保守序列,根据上游序列特征可以预测新的piRNA.将线虫同步化培养至L4时期,分别提取野生和prg-1突变样本中的小RNA,并对其进行高通量测序.基于piRNA上游保守序列特征,在野生线虫L4时期中,发现了967种新piRNA,这些新piRNA在prg-1突变后表达消失.新piRNA的基因座集中分布在四号染色体的2个piRNA簇内,首位碱基以U为主.与已发表的成虫发育时期的PRG-1免疫共沉淀数据比对,发现有153种piRNA存在于与PRG-1免疫沉淀的数据中.同时还发现一些只在野生线虫中表达的non-21nt小RNA,它们与已知piRNA的基因座相同,推测这些non-21nt小RNA可能是其piRNA前体加工的产物.总之,通过小RNA测序,在线虫中发现了一些新的piRNA.

鹌鹑piRNAs和Piwil1基因克隆及表达研究

【目的】目前,国内外尚无有关禽类piRNAs及其结合蛋白Piwi的研究报道,开展禽类小分子RNA及其结合蛋白的研究将为小分子RNA的遗传特性、发生和消失机理以及转基因鸡等研究提供基础依据。【方法】以鹌鹑为研究对象,通过构建cDNA文库和TA克隆测序的方法从睾丸组织中获得piRNAs序列和Piwil1基因的CDS序列,同时采用Q-PCR技术分析了鹌鹑不同生命阶段不同组织中piRNAs和Piwil1基因的表达规律。【结果】从鹌鹑睾丸组织中克隆了13个piRNAs序列和Piwil1基因的CDS序列;Q-PCR结果表明piRNAs和Piwil1基因在鹌鹑不同生命阶段不同组织中均有不同程度地表达。【结论】鹌鹑piRNAs长度与哺乳动物相似;Piwil1基因与红色原鸡有较高的同源性,包含PAZ和Piwi结构域,无信号肽剪切位点,推测其属于Piwi家族蛋白,可能通过降低结合RNA的能力或者影响其它转录因子与结构基因启动子的亲和性发挥调控作用;在睾丸组织中,piRNAs和Piwil1蛋白的表达量均是随着个体的不断发育而增加,推断在禽类中piRNAs可能与Piwi蛋白相互作用共同调控精子的发生过程。

小RNA家族的新成员-piRNA

microRNA(miRNA)和small interfering RNA(siRNA)在真核生物生命活动的基本过程中发挥着重要的调节作用。随着对siRNA和miRNA研究的不断深入,最近科学家在研究大鼠雄性精子时发现哺乳动物睾丸内存在另一种新型的小RNA分子,该分子在精子发生过程中起着重要的生理调节作用,该种小分子RNA被命名为piRNA,在功能、分布和分子特征等方面piRNA较miRNA和siRNA存在着显著的不同,对piRNA深入研究有望揭示出机体内在的基因表达调节机制。

精浆piRNA对精子DNA完整性及辅助生殖技术结局的影响

目的通过检测男性不育症患者精浆中存在的睾丸特异piRNA与精子DNA损伤程度的关系,探讨其对精子DNA完整性及辅助生殖技术(ART)结局的影响。方法分析149例男性不育症患者精液质量及精子DNA完整性;按精子DNA碎片指数(DFI)将不育症患者分为:A组(DFI≤15%)、B组(15%<DFI<30%)、C组(DFI≥30%),采用实时荧光定量聚合酶链式反应(Q-PCR)检测各组患者精浆中piRNA-013423和piRNA-023386的表达量,比较各组患者受精率、卵裂率、优胚率、生化妊娠率及临床妊娠率的差异。结果与A、B组比较,C组的精子密度、前向活动精子、精子活动率、正常形态率均明显下降(P<0.05),A、B两组比较,B组精子活动率下降(P<0.05)。A、B、C三组中,C组患者piRNA-013423、piRNA-023386表达均低于A、B组(P<0.01);C组患者受精率、卵裂率、优胚率、生化妊娠率及临床妊娠率均低于A、B组(P<0.01)。结论男性不育症患者存在精子DNA不同程度的损伤,精浆中piRNA的水平与精子DNA完整性有关,DNA完整性差的患者精浆piRNA表达降低,且影响ART临床结局。提示piRNA可能通过某些信号通路调控精子DNA损伤,但具体机制需要下一步深入研究探讨。

piRNA:一类新的非编码小RNA

piRNA(Piwi-interacting RNA)是从哺乳动物生殖细胞中分离得到的一类长度约为30nt的小RNA,并且这种小RNA与PIWI蛋白家族成员相结合才能发挥它的调控作用。目前,越来越多的文献表明piRNA在生殖细胞的生长发育中的调控是由于Piwi-piRNA复合物引起的基因沉默导致的,但由于对piRNA的研究尚处于初级阶段,它的一些具体的功能和生源论尚在研究当中。综述了piRNA的最新研究进展。

piRNA的功能研究进展

piRNA是一类种类繁多的小RNA,通常在生殖类细胞中表达,其功能是抑制转座子的转座,维持基因组结构的稳定性。对线虫piRNA研究发现,piRNA还具有记忆基因表达的功能。体细胞和癌细胞中piRNA的发现,更凸显了piRNA功能的重要性和多样性。本文梳理了近几年来piRNA功能研究的最新成果,包括piRNA在调控转座子、mRNA、lncRNA、DNA甲基化修饰、染色体表观修饰等方面的功能,同时也探讨了piRNA和癌症的关系。

piRNA的生物学功能

非编码小RNA(non-codingRNA,ncRNA)主要有siRNA(smallinterferingRNA)、miRNA(microRNA)和piRNA(piwi-interactingRNA)三类,其中piRNA是近年来新发现的一类小RNA分子,特异性地同Argonuat蛋白家族中的Piwi亚家族蛋白结合,主要在生殖细胞系中表达,对维持生殖系DNA完整、抑制转座子转录、抑制翻译、参与异染色质的形成、执行表观遗传调控和生殖细胞发生等均有重要作用.piRNA基因几乎遍布于整个基因组,但呈高度不连续性分布,大部分定位于20～90kb的染色体基因簇上.与来自于双链RNA的siRNA和发卡结构miRNA不同之处是piRNA来自长单链RNA前体,或者是两股非重叠的反向转录前体,其生成与Dicer无关.作为调节RNA(riboregulator),piRNA和miRNA可能在动物起源早期就已经出现了,帮助生命进入了一个多细胞动物的时代,产生了今天的生物体复杂性和多样性.piRNA成为ncRNA的研究热点,进展飞快,有很多综述及时介绍piRNA的研究进展,本文结合siRNA、miRNA的特点介绍了关于piRNA的形成机制和作用的最新研究成果.

piRNA的发生和相关蛋白的研究进展

小RNA能在多水平(染色体构建、转录、翻译、RNA修饰和稳定等)对基因的表达进行调控。piRNA(Piwi-interacting RNA)主要参与生殖细胞的发育、转座子的沉默、异染色质的形成和生殖细胞DNA完整性的维持等过程,对遗传物质的稳定遗传具有重要意义。作为一类新型的小RNA,piRNA受到了广泛关注。从2006年发现至今,科研工作者对piRNA的发生和功能做了大量的推测、探索和验证。研究发现,piRNA主要分布在动物体睾丸的精原细胞和卵巢的卵母细胞内,果蝇卵巢体细胞(卵泡细胞)也存在少量的piRNA。piRNA在生殖细胞和体细胞内通过不同的途径产生,体细胞途径相对简单,生殖细胞途径主要通过"乒乓循环"实现。参与"乒乓循环"的3种Argonaute蛋白中,Piwi位于细胞核中,Ago3和Aub位于细胞质中,这一现象暗示piRNA可能在不同的区室内产生并发挥功能。piRNA 3′端的甲基化现象普遍存在,这对piRNA的稳定性具有重要意义,但并不是决定成熟piRNA长度的必需条件。piRNA相关蛋白质的已知功能是预测其产生过程和功能的重要线索,目前已有部分与piRNA产生和功能相关的蛋白质被发掘。另外,piRNA的调控网络比siRNA(Small interference RNA)和miRNA(microRNA)更加复杂,因此新的研究方法体系的出现加快了科研工作者对piRNA发生和功能的研究进程。本文主要就piRNA的生物发生、产生和功能相关蛋白及研究方法的研究进展做一简要论述。

新型小分子RNA-piRNAs的研究进展

由非编码小分子RNA(siRNAs,miRNAs)诱导的RNA干涉作为基因功能研究、基因治疗等新工具,目前已成为分子生物学的研究热点。最近,一种新型小分子RNA-piRNAs在老鼠的生殖细胞中被发现,特异性地与Miwi蛋白结合,被认为是精子发育及合子形成过程中必不可少的。本文就piRNAs的发现、遗传特性和可能的作用模式作一综述,并阐述了研究意义和应用前景。

piRNA在生殖系统中的功能研究进展

piRNA(Piwi-interacting RNA)是2006年发现的一种新的小RNA,长度约24到30个核苷酸,其作用与Dicer酶无关,与Piwi蛋白家族成员相结合才能发挥作用。目前研究piRNA的功能都基本限定在生殖细胞中,近来研究表明piRNA对于生殖细胞功能的很多环节有巨大的影响,而且对生殖支持细胞的影响的研究也有了进展。本文就piRNA在生殖系统中的功能的研究进展作一综述。

基于K-mer-SVM的piRNA预测

采用支持向量机(SVM)结合K-mer分布特征预测piRNA.利用多种生物的非编码RNA序列数据库,从中挑选出piRNA序列作为正样本,并以由该数据库构建的非piRNA序列作为负样本,将正样本和负样本构成的数据随机取出50%作为训练集,将剩余的数据作为测试集;提取正样本和负样本序列的K-mer分布特征构建特征矩阵;用SVM对其进行分类,实现piRNA预测.结果表明K-mer-SVM在准确率、正例覆盖率、MCC和F测度等分类指标上均明显优于K-mer-LDA,说明K-merSVM是更好的piRNA预测算法.

piRNA与心脏相关疾病研究进展

非编码基因组与人类疾病的关系一直是研究的热点,而非编码RNA在心血管疾病的研究还处于起步阶段。Piwi蛋白互作RNA(Piwi-interacting RNA,piRNA)是一种小的非编码RNA,可与Piwi蛋白结合,通过DNA甲基化沉默转座子,在生殖系中高表达和得到了广泛的研究。关于piRNA与心脏相关疾病的研究尚在起步阶段。作者对piRNA及其与心脏相关疾病的某些潜在调控关系作一综述。