基于PiggyBac转座子优化稳定表达细胞系的新型瞬时受体电位M2通道抑制剂筛选

目的:使用PiggyBac(PB)转座系统建立稳定表达瞬时受体电位M2(TRPM2)通道的人胚胎肾细胞HEK293T,并进行TRPM2通道抑制剂筛选,为治疗脑缺血等疾病寻找潜在的药物。方法:根据PB转座原理,构建pPB-hTRPM2真核表达载体。将重组质粒和辅助质粒共同转染至HEK293T细胞中,利用系统携带的荧光与膜片钳鉴定TRPM2基因表达,通过Z'因子评估细胞模型是否适用于钙成像法的高通量筛选。利用钙成像法和膜片钳对11个先导化合物分子进行初步活性评价,测定化合物分子对TRPM2通道的抑制活性。利用氧糖剥夺/再灌注(OGD/R)损伤模型和细胞计数试剂盒8(CCK-8)方法验证筛选得到的化合物分子对损伤细胞的保护作用。利用流式细胞术检测细胞活性氧水平。利用小鼠短暂性大脑中动脉栓塞(tMCAO)模型评价化合物的神经保护作用。结果:成功构建pPB-hTRPM2真核表达载体,构建出可高效表达TRPM2基因的HEK293T细胞系,并同时表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)。在筛选获得的嘌呤霉素抗性细胞中,所有细胞荧光明亮可见,诱导后细胞表现出经典的TRPM2通道电流特征,TRPM2通道电流值与瞬时转染对照组差异无统计学意义(P>0.05)。该筛选系统进行钙成像实验的Z'因子为0.5416,表明其适用于高通量筛选。通过钙成像法结合膜片钳筛选出化合物6,其具有显著的TRPM2通道抑制作用,且1.0μmol/L的化合物6能够显著提高OGD/R后SH-SY5Y细胞的存活率(P<0.05),降低活性氧水平(P<0.05),0.3、1.0 mg/kg的化合物6能降低tMCAO小鼠脑梗死体积百分比(均P<0.05)。结论:利用PiggyBac基因编辑技术成功构建了TRPM2基因稳定表达细胞系,利用钙成像法和膜片钳在候选化合物中成功筛选出一个高亲和力的新的TRPM2通道抑制剂。该抑制剂可以通过降低细胞活性氧水平缓解OGD/R后细胞损伤,并对小鼠脑缺血再灌注损伤具有保护作用。

基于PiggyBac转座系统的低溢漏诱导型Tet-On过表达体系的建立及应用

为避免诱导基因稳定表达的Tet-On诱导表达系统溢漏表达,实现简便且高效的外源基因稳定诱导表达,本研究拟在Tet-On调控的转录水平基础上,将基于稳定配体Shield-1的不稳定结构域FK506结合蛋白引入目的基因的N端,从蛋白水平控制其本底表达水平.为验证该系统的效果,本研究以荧光蛋白TdTomato为报告基因,经流式分析结果证明优化后的体系较原体系的溢漏表达在蛋白水平上降低7倍左右.将该系统应用于基于小鼠胚胎干细胞的体外牙向分化模型,在诱导因子Dox和稳定配体Shield-1的协同作用下,诱导表达牙齿发育相关转录因子Hand2提高了牙向分化诱导的完成度.

基于PiggyBac转座系统的CD19-CAR载体的构建及功能鉴定

目的:开发基于PiggyBac(PB)转座系统的电转染CAR-T细胞制备方法并鉴定其体外抗肿瘤功能。方法:采用健康人外周血单个核细胞(PBMC)制备T细胞,通过分子克隆技术将CD19基因克隆到PB质粒(转座子)中后经电转染法将转座子和转座酶质粒导入激活的T细胞中,并测定其转染效率,最后运用流式细胞术及荧光素酶发光实验评估其对人Burkitt’s淋巴瘤Raji细胞的杀伤能力。结果:电转染制备的CD19 CAR-T细胞转染效率较高(>60%),呈剂量依赖性,且CAR-T细胞相对于Pan-T细胞对Raji细胞杀伤能力显著(P<0.05)。结论:开发的PB转座系统的电转染方法可行,在体外对肿瘤细胞具有显著的杀伤能力,具备临床运用于CD19 CAR-T细胞制备的潜力。

基于piggyBac转座子转hGM-CSF基因家蚕的研究

将由家蚕核型多角体病毒IE-1基因启动子控制下的hGM-CSF基因克隆到p igA3GFP载体中,构建了家蚕转基因载体p igA3GFP[IE-GMCSF],利用压力渗透法和精子介导法将其与辅助质粒helper p igA3一起导入家蚕蚕卵,获得产生绿色荧光的家蚕,次代产生荧光蚕的比例分别为0.17%,0.15%。将次代荧光蚕与正常蚕交配后代(G1)的荧光蚕个体再相互杂交,连续进行多代选育,获得了稳定遗传的转hGM-CSF基因家蚕品系。

piggyBac转座子介导的家蚕细胞转基因研究初探

为探讨稳定转化家蚕细胞表达外源基因的新方法,以家蚕核型多角体病毒(BmNPV)极早期蛋白基因(ie-1)启动子元件驱动新霉素抗性基因(neor),并克隆至具有绿色荧光蛋白基因(gfp)标记的昆虫转座子载体piggyBac中,构建转基因载体pigA3-IE-Neo。以该载体转染家蚕BmN细胞,用终浓度800μg/mL的遗传霉素(geneticin,G418)筛选3个月,获得了稳定转化的细胞,呈现绿色荧光的细胞数达80%以上。通过PCR鉴定证实了细胞基因组DNA中neor基因和gfp基因的存在。

piggyBac转座子在牛基因组的整合位点及特征分析

piggyBac(PB)转座子作为一种遗传工具被广泛应用于多个物种的转基因及插入突变研究,目前PB转座子在牛中的相关研究还较少。为了获得PB转座子在牛基因组中的整合位点,总结其转座特征,文章构建了PB[CMV-EGFP]和pcDNA-PBase二元转座系统,利用细胞核电转技术共转染牛耳组织成纤维细胞,经G-418筛选,获得了稳定转染EGFP的转基因细胞系;提取细胞基因组DNA,利用基因组步移技术扩增PB转座子5′Bac区插入位置的DNA序列;通过与牛基因组序列进行BLAST比对,得到PB转座子在牛基因组中的插入位点。文章共获得了8个有效的整合位点,但仅有5个位点定位到染色体1、2、11和X染色体上。序列分析表明:在牛基因组中,PB转座子可特异性的插入到"TTAA"位置,并整合到基因间的非调控区;分析整合位点"TTAA"相邻一侧的5个碱基组成,发现PB转座子5′端倾向于插入到GC(62.5%)碱基富集区。该研究表明,PB转座子可以在牛基因组中发生转座,获得的整合位点信息为利用PB转座子在牛上开展遗传学研究提供了理论参考。

piggyBac转座子在绒山羊基因组中的整合位点及其特征分析

【目的】构建piggyBac(PB)转座子表达载体系统,研究PB转座子在绒山羊基因组中的整合位点。【方法】构建pB-CMV-EGFP-Neo转座载体和pcDNA-Trans辅助载体,利用lipofectamine 2000介导共转染绒山羊胎儿成纤维细胞,经G418筛选获得稳定转染的转基因细胞系。提取转基因细胞基因组DNA,利用反向PCR检测piggyBac转座子整合位点。【结果】构建了转座系统并成功介导外源基因在绒山羊成纤维细胞染色体中整合,获得了转基因细胞系;反向PCR检测显示在绒山羊基因组中有21个PB转座子整合位点;整合位点TTAA毗邻一侧的5个碱基组成中,PB转座子3′倾向于插入到富含AT(58.35%)碱基的区域,PB转座子5′倾向于插入到富含GC(57.8%)。【结论】PB转座子可在绒山羊基因组中发生高效转座,获得的整合位点信息可为利用PB转座子开展绒山羊研究提供理论参考。

A3启动子缺陷piggyBac转座子在家蚕中的转基因研究

构建了A3启动子缺陷piggyBac转座质粒,以增强型绿色荧光蛋白基因EGFP为标记基因对家蚕品种N is-tari进行转基因实验,发现其具有较高的表达EGFP的转化效率,G0代中EGFP阳性蛾区检出占总注射蚕卵的比率达0.618%,且EGFP的表达呈组织特异性。PCR实验分析也证实了标记基因的成功导入。该实验中标记基因及转基因阳性个体均易于检出,为启动子缺陷转基因方法在家蚕组织特异性启动子筛选研究上的应用奠定了基础。

piggyBac转座子介导的转基因家蚕丝腺生物反应器研究进展

综述了基于piggyBac转座子的转基因家蚕丝腺生物反应器表达外源蛋白的3个关键环节:(1)外源目的基因高效插入家蚕基因组;(2)转基因家蚕的高效、快捷的检测;(3)具有生物活性的外源目的蛋白的高效表达和纯化。同时介绍了有关转基因家蚕丝腺生物反应器表达外源蛋白的研究进展,为更好地利用转基因家蚕丝腺生物反应器表达外源蛋白提供了参考。

PiggyBac转座酶转基因小鼠模型的建立

目的建立表达PiggyBac转座酶转基因小鼠模型,为研究PiggyBac转座子介导基因修饰在小鼠中的应用提供工具。方法利用Cytomegalovirus(CMV)启动子驱动PiggyBac转座酶基因的表达,经显微注射法建立C57BL/6J表达PiggyBac转座酶的转基因小鼠。PCR鉴定转基因小鼠的基因型,RT-PCR检测PiggyBac转座酶在小鼠生殖系睾丸中的表达情况。PiggyBac转座酶转基因小鼠活性的检测,是通过与转座子供体转基因小鼠杂交检测供体位置变化来确定的。结果显微注射产生7只转基因小鼠并能传代,经RT-PCR筛选出一株在睾丸中相对高表达PiggyBac转座酶的转基因小鼠。随后与转座子供体转基因小鼠杂交,子代双阳小鼠与野生型小鼠杂交基因型分离,产生的子代转座子供体单阳性小鼠中具有转座子供体片段的转座反应。结论成功建立了表达Piggy-Bac转座酶转基因小鼠动物模型,该模型为PiggyBac转座子技术在小鼠中的应用提供了有价值的工具动物。

二化螟piggyBac类转座子的克隆与分析

piggyBac转座子是DNA型转座子,广泛分布于生物体内。基于piggyBac转座子超家族成员IFP2开发的转基因工具载体是目前转基因研究中使用最广泛的载体之一,因此piggyBac转座子的研究受到广泛的关注和重视。本文是对二化螟Chilo suppressalis内源性piggyBac类转座子(piggyBac-like element,CsuPLE)的首次报道。克隆的CsuPLE(GenBank登录号:JX392388)全长2537bp,包含一个长1914bp的完整开放阅读框(open reading frame,ORF),编码含637个氨基酸残基的转座酶,转座酶中含有piggyBac家族保守的"DDD-domain"。CsuPLE全长序列具有完全对称的13bp反向末端重复序列(inverted terminal repeats,ITRs)以及非完全对称的21bp内部重复序列(internal repeats,IRs),在二化螟基因组上插入在特征性的"TTAA"靶位点重复(target site duplication,TSD)处。在我国地理跨度很大的不同二化螟种群中均存在结构完整的CsuPLE序列。本研究结果为深入研究piggyBac转座子的结构与功能的关系提供了新的素材,也为评价利用转座子载体系统在二化螟体内进行转基因操作的可行性和安全性提供了重要的理论基础。

piggyBac转座子应用研究进展

piggyBac转座子是来源于鳞翅目昆虫粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)的DNA型转座子。目前piggyBac转座子已成为在昆虫中应用最广泛的转座子之一。近年来国内外研究者更将其应用领域拓宽到了鱼类,寄生虫和哺乳动物等转基因研究中。随着对piggyBac转座子功能和分布的深入认识,piggyBac转座子将更多应用于基因功能研究,基因治疗,转座子介导的细胞系基因诱变及基因工程蛋白表达等基础研究和应用研究中。

昆虫转基因载体——piggyBac转座子

piggyBac转座子在分类上属于真核生物的第二类转座子 ,是一个自主因子 ,长 2 4 76bp ,有短的末端反向重复序列 (ITR)和一个可读编码框 (ORF) ,ITR长 1 3bp ,ORF长 2 1kb。piggyBac转座子可以在基因组中切出和转座 ,切出和转座总是发生在特征性的TTAA四核苷酸目标位点序列 ,转座频率较高 ,而且piggyBac转座子受生物体种类的限制性较少。利用piggyBac转座子构成的载体———辅助质粒系统已成功地获得了转基因地中海果蝇、黑腹果蝇和家蚕。

PiggyBac转座子:人类基因编码研究的新工具

转座子是一种不依赖于同源性重组即可在宿主基因组中发生基因座位置改变的DNA片段。PiggyBac(PB)转座子是一种可移动的遗传元素,并通过"剪切-黏贴"机制在有效载体和染色体之间调换。在换位过程中,PB转座子识别具体转座子的反向末端重复序列(inverted terminal repeat sequences,ITRS)位于转座子载体的2端,有效地移动原来位置的内容,并整合到TTAA染色体。PB转座子系统强大的活动使在PB载体上位于2个ITRS之间的基因容易地动员到靶基因。PB转座子因其高转座活性,转座安全、稳定与无痕移除的特性而备受关注,在分子医学研究中有较好的应用前景。针对其特性,PiggyBac转座子可被用于基因转移载体、癌基因筛选工具和基因治疗的载体。文中就其在基因编码研究中的应用作一综述。

转座子Sleeping Beauty和PiggyBac

近10年来,得益于转座子Sleeping Beauty(SB)和PiggyBac(PB)的发现和完善,转座子作为一种遗传工程工具在脊椎动物的基因遗传研究中得到广泛应用.SB和PB宿主范围极其广泛,从单细胞生物到哺乳动物都能够发挥作用.转座过程需要转座序列和转座酶的存在,类似于"剪切"、"粘贴"的方式.转座子载体系统转座时可携带一段外源DNA序列,利用这一特性可以用于实现目的基因的转移,现已广泛用于转基因动物、基因功能研究、基因治疗等领域.当转座系统与基因捕获技术相结合,不仅可研究插入突变基因的功能,还能通过所携带的报告基因获得捕获基因的表达图谱.作为非病毒载体的SB和PB转座系统,由于具有高容量、高效率和高安全性等优势,并且PB在转座后不留任何足迹,不会造成遗传物质的不可预测改变,在动物基因工程以及基因治疗方面具有诱人的前景.

piggyBac转座子介导的牛A-FABP表达载体的构建与鉴定

【目的】构建以piggyBac(PB)转座子为载体元件,绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因,Neomycin(NEO)为抗性基因,alpha-肌动蛋白(α-actin)为启动子的A-FABP基因特异性表达载体pPB-AFABP,并验证其转座活性。【方法】通过PCR方法合成PB转座子骨架序列、NEO-EGFP、α-actin启动子以及A-FABP基因序列,并将各个序列连接构建成转基因载体pPB-AFABP;用脂质体法将供体质粒pPB-AFABP和辅助质粒pCAG-PBase组成的PB二元系统及质粒pPB-AFABP分别转染牛成纤维细胞,通过G418筛选得到转基因细胞。【结果】经过酶切和测序鉴定,载体pPB-AFABP构建正确;PB二元系统的阳性克隆数明显多于转座子载体pPB-AFABP的克隆数;PCR鉴定结果表明,牛成纤维细胞中存在目的基因A-FABP。【结论】成功构建了转基因表达载体pPB-AFABP,且证实PB转座子在牛成纤维细胞中具有较高的转座活性。

反向PCR鉴定piggyBac介导的哺乳动物细胞转基因研究

利用反向PCR技术,研究piggyBac介导的转基因哺乳动物中外源基因整合位点信息。首先在转座子piggyBac中插入巨细胞病毒(CMV)启动子元件驱动的绿色荧光蛋白基因(EGFP),构建用于转染哺乳动物细胞的转基因载体pXL-CMV-EGFP;同时构建以CMV启动子驱动的转座酶基因载体。将2种载体以脂质体共转染HEK293细胞,以单独的pXL-CMV-EGFP转染为阴性对照,结果表明,2个处理均观察到了绿色荧光蛋白的表达。通过反向PCR鉴定,在共转染转座酶的细胞基因组DNA中检测到外源基因的整合,而阴性对照中没有检测到,研究结果为进一步分析整合位点的信息及转基因检测提供了依据。

PiggyBac转座子介导的转FGF5s基因绒山羊胎儿成纤维细胞的制备

本研究旨在建立可稳定表达FGF5s的绒山羊胎儿成纤维细胞系。采用RT-PCR方法,从陕北白绒山羊皮肤组织cDNA中克隆FGF5s基因,构建PB转座子介导的真核表达载体PB-EGFP-FGF5s;在脂质体的介导下,将PB-EGFP-FGF5s载体和转座酶载体共转染绒山羊胎儿成纤维细胞,通过嘌呤霉素进行稳定筛选。并利用PCR和RT-PCR鉴定FGF5s基因在细胞基因组中的整合及表达情况。结果表明,成功克隆了陕北白绒山羊FGF5s基因并构建了PB-EGFP-FGF5s真核表达载体;PCR结果显示,FGF5s已整合到细胞基因组中;RT-PCR结果表明,该基因在转录水平上表达。另外,转染试验表明PB转座子可在绒山羊胎儿成纤维细胞中发生高效转座。本研究为制备绒山羊转基因细胞系提供了一种高效的方法,并为下一步通过核移植方法获得转基因绒山羊奠定了基础。

利用PiggyBac转座系统构建稳定表达鹅RIG-I的DF-1细胞系

维甲酸诱导基因-I(retinoic acid inducible gene-I,RIG-I)是最近几年发现的一种细胞内模式识别受体,能够特异性的识别并结合病毒RNA,进而发挥抗病毒效应。RIG-I在进化中相对保守,但已有报道和我们的前期研究显示:家禽中鸭和鹅体内均有RIG-I受体,但鸡却缺乏RIG-I受体。为了研究这种天然缺失对鸡是否有不利影响,本研究利用PiggyBac转座系统将鹅源RIG-I转染入鸡胚成纤维细胞系DF-1,两次亚克隆后获得单个克隆,以荧光、RT-PCR及Western blot进行鉴定,最终获得稳定表达鹅RIG-I的DF-1细胞系,为进一步研究鸡的先天性免疫机制和鹅RIG-I的功能打下基础。

piggyBac转座子调节pPiggyBac-Rb质粒的构建

背景:外源性Rb基因的导入是抑制视网膜母细胞瘤细胞增殖的有效途径,piggyBac转座子介导的外源基因表达载体高效安全,在基因治疗方面具有广阔的应用前景。目的:探讨piggyBac转座子介导的外源性Rb基因的转染效率及其对视网膜母细胞瘤细胞的抑制作用。方法:采用RT-PCR技术扩增Rb基因编码区Rb cDNA,定向插入到载体pPiggyBac,获得PiggyBac调节的Rb表达质粒pPiggyBac-Rb;通过单独转染或合并pPiggyBac-helper转染人视网膜母细胞瘤细胞SO-RB50。结果与结论:考马斯亮蓝染色证明piggyBac转座子系统的转染效率最高,荧光定量PCR以及免疫荧光实验证明其介导的目的基因Rb与宿主SO-RB50细胞基因组整合效率最高且可在细胞中长期稳定表达,MTT实验证明经其所介导的外源性Rb基因表达对细胞活性影响最为显著。结果提示piggyBac转座子有可能成为视网膜母细胞瘤基因治疗的安全有效载体。