PIWI蛋白相互作用RNA-47851在胃腺癌中的表达及其对增殖的影响

目的探讨PIWI蛋白相互作用RNA-47851(piR-47851)在胃腺癌中的表达、临床病理意义及其对增殖的影响。方法通过实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检查79例胃腺癌组织中piR-47851的表达情况,分析piR-47851的表达水平与临床特征和生存预后的关系。通过细胞增殖实验观察piR-47851对胃癌细胞增殖活性的影响。应用信息学网站预测piR-47851的下游靶基因。建立MAPK1基因3′非翻译区(UTR)的野生型和突变型质粒,应用双荧光素酶报告系统验证piR-47851与MAPK1基因3′UTR结合从而抑制MAPK1蛋白合成。应用Rescue实验确认piR-47851对MAPK1直接调控作用,并探讨piR-47851/MAPK1对胃癌细胞增殖的影响。通过实验性裸鼠皮下荷瘤实验观察降低piR-47851表达对移植瘤体积和质量的影响;通过增殖指标Ki-67染色观察降低piR-47851表达对移植瘤细胞增殖活力的影响。结果qRT-PCR实验结果提示,79例胃腺癌组织中piR-47851的表达水平显著高于癌旁正常胃组织(P<0.05)。piR-47851表达水平与肿瘤大小、分化程度和生存预后密切相关(P<0.05)。生物信息学提示piR-47851与MAPK1基因3′UTR有互补的结合位点。双荧光素酶报告基因实验得出在MAPK1野生型转染组中,piR-47851能显著抑制荧光酶活性,而在MAPK1突变组中无抑制作用。CCK-8增殖活性实验表明,过表达piR-47851后,胃癌细胞增殖活性升高;降低piR-47851后,细胞增殖活性下降,差异均有统计学意义(P<0.05)。Rescue实验提示,在改变piR-47851和(或)MAPK1的表达后再通过qRT-PCR检测MAPK1的表达水平,MAPK1都能受到piR-47851的调控。在功能上过度表达MAPK1可以降低piR-47851对胃癌细胞的增殖促进作用,而减低MAPK1表达可进一步提升胃癌细胞的增殖活性。在裸鼠荷瘤实验中,降低piR-47851表达后肿瘤生长体积和质量显著减小(P<0.05)。增殖指数Ki-67染色表明减低piR-47851表达后增殖活性细胞数目显著低于对照组(P<0.05),验证了piR-47851能促进细胞增殖。结论胃腺癌组织中piR-47851表达水平升高,与肿瘤大小和生存预后密切相关。piR-47851通过与MAPK1的3′UTR结合来下调MAPK1蛋白表达,从而促进胃癌的细胞增殖。

PIWI-interacting RNA在肺癌中的研究进展

PIWI-interacting RNA(piRNA)是一类结合argonaute蛋白中PIWI亚家族发挥作用的小分子RNA,于多种人类组织中以组织特异性的方式表达,在肿瘤细胞的维持发展过程中起重要作用。肿瘤中piRNA的机制也是多样的,包括调控转录、翻译和表观遗传。但目前有关肺癌发生、发展的分子机制尚未明朗,所以为进一步深入研究肺癌发病机制和扩展诊疗手段提供参考依据,本文对piRNA与肺癌的最新研究进行综述。

PIWI相互作用RNA017724在肝细胞癌中的表达及其对细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的影响

目的:分析PIWI相互作用RNA017724在肝细胞癌组织、人肝癌细胞系中的表达及其对细胞增殖、凋亡、侵袭及迁移的影响。方法:采用实时定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)检测肝细胞癌组织和肝癌细胞系中PIWI相互作用RNA017724的表达水平。将PIWI相互作用RNA017724模拟物和抑制剂转染SMMC-7721和PLC/PRF/5细胞,采用CCK-8法和细胞集落形成实验检测各组细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞凋亡率,Transwell实验检测各组细胞迁移和侵袭能力。结果:肝癌组织中PIWI相互作用RNA017724表达水平显著低于匹配的相邻正常肝组织,差异有统计学意义(P<0.05);PIWI相互作用RNA017724低表达患者的生存期较短。PIWI相互作用RNA017724抑制剂促进SMMC-7721和PLC/PRF/5细胞的增殖、迁移和侵袭,而模拟物抑制SMMC-7721和PLC/PRF/5细胞的增殖、迁移和侵袭。PIWI相互作用RNA017724对细胞凋亡无明显作用。结论:PIWI相互作用RNA017724抑制HCC细胞的增殖、迁移和侵袭。

果蝇脂肪体中Piwi影响生长发育的新功能鉴定

Piwi(P-element induced wimpy testis)是一类与生殖相关的蛋白,主要在生殖系统中表达,对生殖细胞的形成和维持DNA的完整性及稳定性十分重要,但其在其他器官和组织中的功能尚不清楚。文章利用模式生物果蝇进行研究,发现降低Piwi在脂肪体中的表达导致果蝇的羽化率、生长周期和寿命出现问题,并且脂肪体的功能受到严重影响,说明脂肪体内表达的Piwi蛋白对于果蝇生长发育是必须的。进一步的研究表明,在脂肪体细胞内敲低Piwi基因引起活性氧(reactive oxygen species,ROS)的大量产生,干扰脂肪体细胞的储存功能,进而影响果蝇的生长发育。该研究为鉴定Piwi在脂肪体的新功能提供了新思路,并且对相关疾病的治疗具有重要价值。

PIWI相互作用RNA:结直肠癌诊断和预后的生物标志物

PIWI相互作用RNA(PIWI-interacting RNA,piRNA)是一种新型小分子非编码RNA,它通过与PIWI蛋白形成复合体发挥调节作用,主要存在于哺乳动物(人类、小鼠等)的干细胞与生殖细胞中。越来越多的研究表明,piRNA可以通过表观遗传改变来调节基因表达,包括转座子沉默、DNA甲基化和染色质修饰等,在肿瘤的发生中起关键性作用。因此,piRNA具有作为生物标志物的可能,为癌症诊断与预后监测提供新的方法。文章综述了piRNA在结直肠癌中的生物学作用,为结直肠癌的发病机制和寻找其有效生物标志物的研究工作提供线索。

恒河猴piwil4基因的鉴定与表达分析

为了研究人类近亲恒河猴中PIWI家族蛋白PIWIL4的结构和表达情况,文章首次利用同源比对和RT-PCR方法克隆了恒河猴piwil4基因,检测了其mRNA在恒河猴心脏、脑、结肠、附睾和睾丸5种组织中的表达情况,利用生物信息学的方法对恒河猴piwil4基因和人的PIWIL4(HIWI2)基因编码的蛋白产物进行了同源性分析和结构域分析,并进一步利用免疫组化的方法比较了PIWIL4蛋白在成人、成年恒河猴和性未成熟恒河猴睾丸组织中的表达分布。结果表明,恒河猴piwil4 mRNA在多组织中表达,恒河猴和人的PIWIL4蛋白的氨基酸序列同源性达97%以上,均含有PAZ和Piwi结构域,它们在两物种成年个体睾丸组织中空间分布一致,但在不同发育阶段恒河猴睾丸组织中的分布发生了改变,幼猴中PIWIL4蛋白主要表达于生精小管细胞的细胞核,在成年猴睾丸组织中则表达于各种细胞的胞浆中。上述结果提示,piwil4基因在人类和恒河猴精子发生过程中作用类似,PIWIL4蛋白在幼猴和成年猴睾丸组织中的表达差异提示它们在不同发育阶段功能的改变。

鹌鹑piRNAs和Piwil1基因克隆及表达研究

【目的】目前,国内外尚无有关禽类piRNAs及其结合蛋白Piwi的研究报道,开展禽类小分子RNA及其结合蛋白的研究将为小分子RNA的遗传特性、发生和消失机理以及转基因鸡等研究提供基础依据。【方法】以鹌鹑为研究对象,通过构建cDNA文库和TA克隆测序的方法从睾丸组织中获得piRNAs序列和Piwil1基因的CDS序列,同时采用Q-PCR技术分析了鹌鹑不同生命阶段不同组织中piRNAs和Piwil1基因的表达规律。【结果】从鹌鹑睾丸组织中克隆了13个piRNAs序列和Piwil1基因的CDS序列;Q-PCR结果表明piRNAs和Piwil1基因在鹌鹑不同生命阶段不同组织中均有不同程度地表达。【结论】鹌鹑piRNAs长度与哺乳动物相似;Piwil1基因与红色原鸡有较高的同源性,包含PAZ和Piwi结构域,无信号肽剪切位点,推测其属于Piwi家族蛋白,可能通过降低结合RNA的能力或者影响其它转录因子与结构基因启动子的亲和性发挥调控作用;在睾丸组织中,piRNAs和Piwil1蛋白的表达量均是随着个体的不断发育而增加,推断在禽类中piRNAs可能与Piwi蛋白相互作用共同调控精子的发生过程。

中华鲟piwil1基因的克隆表达特征研究

Piwi是鱼类配子发生和性腺发育的重要调控因子。本研究从中华鲟(Acipenser sinensis)性腺中克隆得到了piwi基因的全长c DNA序列,该序列长3 393 bp,开放阅读框为2 583 bp,编码860个氨基酸。氨基酸序列多重对比发现,该序列具有PAZ和PIWI保守结构域,与其他鱼类piwil具有较高同源性;系统进化分析显示,中华鲟piwil聚于piwil1分支;因此,所得序列为piwi-like 1基因,命名为Aspiwil1。荧光定量PCR研究表明,Aspiwil1为母源表达,且其表达量随着胚胎发育逐渐降低;Aspiwil1在性腺中大量表达,在脑组织中也有较低水平的表达。性腺组织切片RNA原位杂交结果表明,Aspiwil1仅在生殖细胞表达,且其杂交信号随着卵子发生逐渐增强、精子发生逐渐减弱。本研究为中华鲟配子发生过程中Aspiwil1的功能研究提供了基础。

大鼠肝癌模型中Piwil4、Mael和Ddx4基因mRNA和蛋白表达水平及其与肿瘤检测的关系

PIWI和piRNA的表达水平与肿瘤类型密切相关。Piwil2 mRNA在肝癌中的表达量比肿瘤周围的肝脏组织的表达量高。PIWI/piRNA通路基因Piwil4、Mael和Ddx4为候选癌基因,在多种癌组织中表达,而在肝癌组织中的研究尚无报道。为探讨Piwil4、Mael和Ddx4基因在肝癌组织中表达水平变化的影响,建立了大鼠肝癌模型,并提取血清用ELISA方法检测肿瘤标记物,采用实时荧光定量PCR、蛋白质免疫印迹方法和免疫组织化学方法检测正常肝组织与模型组肝组织中Piwil4、Mael和Ddx4基因mRNA转录和蛋白表达水平。结果表明,大鼠肝癌动物模型血清中肿瘤标记物含量明显升高。Piwil4、Mael和Ddx4基因mRNA及蛋白在肝癌模型组织中高表达。研究表明,肝癌模型组织中Piwil4、Mael和Ddx4基因表达水平有望作为肝癌检测的一种分子标志物。

鸡Piwi蛋白的亚细胞定位研究

通过构建2种真核表达载体比较Piwi蛋白在真核细胞中的表达部位,为进一步研究Piwi蛋白的生物学功能提供依据。采用RT-PCR方法克隆了狼山鸡睾丸组织中Piwi基因CDS,构建含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的融合表达载体pEGFP-C1-Piwi,脂质体PEI介导基因转染NIH-3T3细胞,同时构建pcDNA3.1-Piwi真核表达载体,采用细胞间接免疫荧光方法检测Piwi蛋白在NIH-3T3细胞的表达部位。结果表明,成功克隆出公鸡Piwi基因的全序列CDS,大小为2 604bp,与GenBank中预计的序列基本一致;融合表达载体pEGFP-C1-Piwi在整个细胞中都有表达;而间接免疫荧光方法检测到pcDNA3.1-Piwi载体主要在NIH-3T3细胞质中表达。Piwi蛋白主要在细胞质中表达,采用间接免疫荧光方法比EGFP报告基因法更为可靠,适合目的蛋白的亚细胞定位研究。

PIWIL1在肝细胞癌中的表达及临床意义

目的:探讨干细胞相关蛋白PIWI样蛋白1(PIWI-like protein-1,PIWIL1)在肝细胞癌组织中的表达及临床意义,并探索其表达与患者预后的关系.方法:应用免疫组织化学检测47例肝细胞癌标本中PIWIL1的表达,免疫印迹(Western blot)法检测31例肝细胞癌组织中PIWIL1的表达,分析PIWIL1表达与临床特征及预后的关系.结果:PIWIL1在肝癌组织中高表达,在正常肝组织中低表达,PIWIL1同肿瘤分化程度、有无临近组织侵犯有关,与肿瘤大小及甲胎蛋白(α-fetoprotein,AFP)水平无关;其阳性表达预示患者预后较差.结论:PIWIL1的高表达同病理分化程度、临近组织侵犯相关及患者预后相关.

体外抑制Piwi基因对鸡原始生殖细胞相关基因表达的影响

本研究以鸡原始生殖细胞(Primordial germ cells,PGCs)为材料进行Piwi基因的干扰,并探究Piwi和生殖特异性标记基因CVH、Dazl和CDH及调控干细胞多能性转录因子基因Sox2、Nanog和PouV间的关系。由孵化至19期的鸡胚分离出PGCs,经鉴定后,利用RNA干扰技术抑制Piwi基因表达,相对实时荧光定量PCR检测目的基因的表达。结果发现,体外抑制Piwi后,CVH、Dazl和Nanog表达量显著增加(P<0.05),PouV和Sox2表达量显著下降(P<0.05),CDH表达量变化不显著(P>0.05)。本研究在家禽PGCs中建立Piwi基因干扰模型,并发现其干扰后影响生殖特异性标记基因和干性转录因子的表达,为其在生殖生物学中的功能研究提供了新的依据。

PIWI和肿瘤

PIWI家族成员包含保守的PAZ和PIWI区域,在干细胞自我更新、精子发生、RNA干扰和翻译调控中扮演重要角色。最近研究发现,一些PIWI在肿瘤中呈特异性表达,并与肿瘤的发生、发展相关。PIWI将有可能成为肿瘤诊断和预后判断的一个新的重要指标。研究PIWI表达调控机制,可探讨PIWI在肿瘤基因治疗方面的可行性。

Piwi家族:干细胞分裂中的重要调控基因

Piwi是果蝇卵巢中发现的一个对干细胞的分裂有调控作用的基因。Piwi家族蛋白的表达在各种生物中具有广泛的保守性 ,而且大多参与干细胞自我更新的调控。在果蝇卵巢中 ,Piwi对生殖干细胞的调控方式包括外源调控和内源调控两种 ,而高等动物中的同源物Hiwi只以自调控的方式控制干细胞的分裂和分化。Piwi家族蛋白含有保守结构域Piwibox和PAZ。

优雅蝈螽卵巢Piwi蛋白亚家族成员GiwicDNA序列全长的克隆与生物信息学分析

旨在进一步研究piwi基因在半变态昆虫干细胞自我更新和生殖系细胞发育中的作用。首先对实验室前期测定的优雅蝈螽(Gampsocleis gratiosa)转录组数据进行搜索,成功挑选出piwi基因的同源体,命名为giwi。通过设计特异性引物,采用巢式RT-PCR和RACE末端扩增技术克隆获得该基因cDNA序列。序列分析表明,优雅蝈螽giwi基因cDNA序列全长为3 462 bp,包含1个完整的开放阅读框2 742 bp,编码913个氨基酸,以及一个长度为111 bp的5'端非编码区和609 bp的3'端非编码区。预测的理论蛋白分子量为102.7 kD,等电点为9.55。Giwi蛋白具备Piwi蛋白亚家族全部特征,C端的保守PIWI结构域,中部的保守PAZ结构域和N端可变结构域。同源比对分析得到PIWI结构域具有类似RNA酶H活性中心的DDH三联催化模体,暗示该蛋白具有切割活性。系统发育分析指出昆虫的Piwi和Aubergine可能源于远古基因的重复事件。通过二代测序技术获得的转录组数据可以很好地服务于未来的功能基因研究。

PIWI、Ki-67与肿瘤关系的研究进展

PIWI家族是干细胞分裂中的重要的调控基因,在干细胞的分化和肿瘤形成和发展中起着重大的作用。目前研究发现,PIWI在多种肿瘤组织中高表达,因而它可能作为肿瘤诊断和预后判断的一个新的重要指标。增殖细胞核抗原Ki-67是一种与细胞周期相关的蛋白质,它是一种核增殖标志基因,也与肿瘤的发生及发展密切相关。研究发现它们都具有抑制凋亡、促进肿瘤细胞增殖的作用。

鸡生殖干细胞中Piwi基因的干涉效率

【目的】针对禽类干细胞研究中,存在转染效率与干涉效率低下的问题,通过比较不同干涉方式对鸡原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)中Piwi基因的干涉效果,探讨提高禽类生殖干细胞干涉效率的有效方法。为进一步研究Piwi基因参与干细胞自我更新、RNA沉默以及转录后调控过程等生物学功能研究奠定基础。【方法】根据已建立的原代细胞分离技术,分别从健康鸡群的10日龄和4日龄鸡胚中分离成纤维细胞(chicken embryo fibroblast,CEF)与生殖脊,其中CEF作为PGCs细胞的饲养层,生殖脊经Trypsin-EDTA室温下消化获得PGCs细胞,并通过形态学、化学方法(PAS糖原染色、AKP活性检测)和免疫学方法(TERT抗体、SSEA-1抗体)对其进行鉴定。根据Genbank公布的鸡Piwi基因的m RNA序列(NM_001098852),利用在线软件分别靶向不同位点设计合成得到3个小片段的stealth si RNAs,并将通用无义序列BLOCK-i T^(TM) Alexa Fluor&#174;Red Fluorescent Oligo作为荧光素标记的阴性对照si RNA。同时,在线设计三条干扰序列和一条非特异性阴性对照序列,将其插入线性化空载体p RNA-U6.1,构建不同的sh RNA干涉载体。分别采用不同类型的转染试剂将构建好的si RNA和sh RNA转染PGCs细胞。首先利用通用无义si RNA以及仅带有GFP荧光标记基因的sh RNA载体作为阴性对照,检测si RNA和sh RNA转染效率,确定最佳转染条件。其次,将试验组si RNA和sh RNA在优化条件下转染PGCs细胞,分别收集转染了24、48、72和144 h这4个时间点的细胞,提取各个时间段的总RNA,采用实时荧光定量PCR技术检测Piwi基因m RNA表达水平,并用SPSS软件分析不同处理组的差异。【结果】在对原代分离的PGCs细胞进行了形态学、化学以及免疫学方法鉴定后,确认其所获得的细胞为PGCs细胞且状态良好。根据不同的转染试剂量与si RNA或sh RNA载体量的配比,得出si RNA转染最优条件为si RNA﹕Lipofectamine TM 2000=50 pmol﹕2μL;sh RNA转染最优条件为sh RNA﹕X-Treme GENE HP DNA Transfection Reagent=500 ng﹕1.5μL。在以上最优转染条件下,将试验组si RNA和sh RNA分别转染第二代PGCs细胞。发现在si RNA干涉组中,阴性si RNA组和空白组相比,Piwi基因表达量在24、48、72和144 h差异均不显著(P>0.05);而3个试验组si RNA与阴性对照组相比,在24、48和72 h的Piwi基因表达量均呈现显著下降(P<0.05),但在144 h时表达差异不显著(P>0.05)。在sh RNA干涉组中,空白组和阴性对照组相比,Piwi基因表达量在4个时间点上差异均不显著(P>0.05);而3个试验组与阴性对照组相比,Piwi基因表达量在4个时间点上均显著下降(P<0.05)。与si RNA干涉试验组相比,sh RNA载体表现出更强及更长时间的稳定抑制Piwi基因的效果。【结论】si RNA与sh RNA均能较好抑制目的基因的m RNA表达,不同干涉效果表明采用sh RNA载体具有更好及更长时间的抑制作用,这为RNAi技术在家禽生殖干细胞中的应用研究提供基础资料。

肝细胞癌组织中前列腺干细胞抗原、piwi样蛋白1和T-box转录因子2的表达分析

目的 探讨前列腺干细胞抗原（prostate stem cell antigen,PSCA）、piwi样蛋白1（piwi-like 1,PIWIL1）和T-box转录因子2 （T-box transcription factor 2,TBX2）的表达在肝细胞癌（HCC）中的临床意义.方法 收集2000～2003年HCC和相应癌旁正常组织所制备的石蜡切片各64例,应用免疫组织化学SP方法检测石蜡切片中PSCA,PIWIL1和TBX2蛋白的表达,分析三者的表达与HCC患者临床病理指标的关系.结果 在64例HCC的癌旁正常组织中,PSCA,PIWIL1和TBX2的表达率分别为17％ （11/64）,0％（0/64）和9％（6/64）,而HCC中三者的表达率分别为73％ （47/64）,19％（12/64）和75％ （48/64）,PSCA,PIWIL1和TBX2的表达明显高于癌旁正常组织（x2=40.859,13.241,56.505,P均＜0.05）;PSCA,PIWIL1和TBX2的表达均与患者性别、年龄无明显相关性（x2=0.651～3.864,P值均＞0.05）,但是均与临床分期有关（x2=12.923～39.511,P值均＜0.05）;PSCA的表达率随着HCC的病理分级而升高（x2=18.047,P=0.000）,而PI-WIL1和TBX2的表达则与病理分级无明显相关性（x2=3.356～5.688,P值均＞0.05）;除了PIWIL1以外（x2=3.156,P=0.078）,PSCA和TBX2的表达与淋巴结转移有相关性（x2=6.409～8.466,P值均＜0.05）;PSCA和PIWIL1的免疫染色定位于肝细胞的胞浆中,而TBX2则定位于肝细胞的胞浆和胞核中.结论 PSCA,PIWIL1和TBX2在HCC中的表达研究为HCC发生发展分子机制提供了新的资料,PSCA和TBX2可能会成为治疗肝细胞癌的分子靶点.

PIWI/piRNA在妇科恶性肿瘤中的研究进展

PIWI蛋白相互作用RNA(PIWI-interacting RNA,piRNA)是一类长度为24~31个核苷酸的小RNA,通过与PIWI蛋白结合改变肿瘤表观遗传学特征、调控转录后mRNA水平及蛋白质稳定性,参与恶性肿瘤的增殖、侵袭、转移等发生发展过程;有望成为恶性肿瘤早期诊断及预测预后的生物标志物和新型治疗靶点。子宫内膜癌、卵巢癌和宫颈癌作为妇科三大恶性肿瘤,早期诊断尤为关键,其复发、转移也仍是目前一大难题。本文主要就PIWI/piRNA的生物学特性、表观遗传沉默的相关机制及其在妇科恶性肿瘤中的最新研究进展进行综述。

Piwi蛋白与基因的表达调控及其在肿瘤中的作用

Piwi蛋白是Argonaute蛋白家族的一类,正常情况下可表达于不同物种的雄性睾丸组织中,主要与Piwi相关RNA(piRNA)相互作用,导致转座子基因的沉默,保护生殖干细胞基因组的稳定性和完整性,对生殖干细胞的自我更新、配子和胚胎的发育具有重要的作用。另外,在人类多种肿瘤组织如胃癌、乳腺癌、宫颈癌中发现有Piwi蛋白表达,同时在肿瘤干细胞中也有Piwi蛋白的表达,抑制其表达可通过多种不同机制抑制肿瘤细胞的增殖和凋亡,说明Piwi蛋白与肿瘤的发生发展有关。现就Piwi蛋白调控基因表达及其与肿瘤发生发展的关系作一综述。