p16基因甲基化及蛋白在非小细胞肺癌组织中的表达

目的探讨p16基因甲基化及蛋白在人非小细胞肺癌组织中的表达情况。方法应用甲基化特异性PCR法(MS-PCR)及免疫组化SP法检测45例非小细胞肺癌组织、21例肺良性疾病组织中p16基因甲基化及蛋白的表达情况。结果肺良性疾病中p16基因甲基化阳性率低于癌组织,差异有显著性(P=0.001),p16基因甲基化与非小细胞肺癌细胞分化程度及淋巴结转移情况有明显的相关性(P<0.05);肺良性疾病中p16蛋白阳性率高于癌组织,差异有显著性(P=0.007);p16蛋白表达与非小细胞肺癌临床分期、细胞分化程度及淋巴结转移情况有明显的相关性(P<0.05)。p16甲基化和p16蛋白表达缺失存在相关性(P=0.004)。结论p16基因甲基化及蛋白的表达情况与非小细胞肺癌的发生、发展有关。

肺癌患者血清p16、FHIT、APC基因甲基化检测

目的:检测肺癌患者血清中抑癌基因p16、FHIT、APC的甲基化,探讨它们在肺癌发生和诊断中的临床价值。方法:收集120例原发性肺癌患者(肺癌组)、46例肺良性疾病患者(对照组)的血液标本,采用甲基化PCR方法检测2组患者血清p16、FHIT、APC基因甲基化。采用logistic回归分析肺癌发生的危险因素,计算上述基因甲基化诊断肺癌的准确率。结果:肺癌组血清中p16、FHIT、APC的甲基化率分别为37.5%、34.2%、31.7%,对照组中分别为6.5%、13.0%、10.9%,差异有统计学意义(P均<0.05)。Logistic回归分析提示p16、FHIT基因甲基化均为肺癌发生的独立危险因素,OR(95%CI)分别为7.509(2.160~26.099)、2.927(1.096~7.814)(P均<0.05)。p16、FHIT、APC基因甲基化单项诊断肺癌的准确率分别为53%、49%、47%,3种基因甲基化联合诊断肺癌的准确率为87%,优于单项指标。结论:p16、FHIT基因甲基化均为肺癌发生的独立危险因素;联合检测p16、FHIT、APC甲基化可提高肺癌诊断的准确性。

食管鳞癌组织中p16基因缺失及甲基化检测

目的探讨食管癌组织中p16基因表达缺失的机制。方法采用PCR、DHPLC、MSP及免疫组化的方法,检测45例食管鳞癌组织及其相应的间变组织和正常食管上皮组织中p16基因的缺失、突变、甲基化状态及蛋白表达情况。结果正常食管上皮组织中p16蛋白均为正常表达(45/45,100%),间变和癌组织中异常表达率分别为84.4%(38/45)和91.1%(41/45),3者间异常表达率差异有统计学意义(χ2=20.03,P<0.001)。p16蛋白表达异常的41例癌组织中,纯合型甲基化发生率为80.48%(33/41),杂合缺失发生率58.53%(24/41),不缺失发生率41.46%(17/41),均高于p16蛋白表达正常的癌组织。结论该地区食管癌组织中p16基因主要通过纯合型甲基化失活。

肝癌患者血清p16、Runx3基因甲基化及其与临床病理参数的相关性

目的:探讨血清p16和Runx3基因启动子区CpG岛异常甲基化与原发性肝癌(hepatocellular carcino-ma,HCC)关系。方法:采用甲基化特异性PCR(MSP)法对56例HCC患者、40名健康体检者、40例乙肝患者和40例肝硬化患者血清p16和Runx3基因甲基化状况进行检测。结果:HCC患者血清p16和Runx3基因甲基化检出率分别为69.6%(39/56)和66.1%(37/56),而肝硬化患者、乙肝患者和健康体检者均未检出基因甲基化,与HCC组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。Logistic回归分析结果均未发现以α=0.05为显著性水准进入回归模型的变量。结论:HCC患者血清中可检测到p16和Runx3基因的甲基化,有助于肝癌的诊断、治疗和预后评估。

多发性骨髓瘤中p16、p15基因甲基化及其mRNA表达的研究

目的探讨p16、p15基因的高甲基化及其mRNA转录阻抑与多发性骨髓瘤的发病和进展之间的关系。方法采用甲基化敏感的限制性内切酶联合聚合酶链反应方法(REP法),检测了28例多发性骨髓瘤患者骨髓细胞p16、p15基因5'端启动子区的甲基化状态,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测多发性骨髓瘤患者p16、p15基因mRNA表达情况。结果p16、p15基因启动子区过度甲基化率分别为57.14%(16/28)、64.28%(18/28),53.57%(15/28)患者同时存在p16、p15基因启动子区过度甲基化。大多数存在甲基化的患者不表达p16、p15基因mRNA。结论p16、p15基因的高甲基化与多发性骨髓瘤的发病有关,p16、p15基因甲基化与其转录阻抑高度相关。

前列腺癌中E-钙粘素、p16及雌激素受体基因甲基化的检测及其临床意义

目的:研究前列腺病变中E-钙粘素、p16和雌激素受体(ER)基因启动子CpG岛甲基化状况及其与临床资料的关系,探讨基因过甲基化在前列腺癌(PCa)发生发展中的作用及其临床意义。方法:收集石蜡包埋前列腺全切术标本:良性前列腺增生(BPH)13例,高级别前列腺上皮内瘤(HGPIN)10例,有随访记录的PCa 20例。采用甲基化特异性PCR(MSP)技术对E-钙粘素、p16和ER基因CpG岛甲基化进行检测。结果:E-钙粘素、p16和ER基因过甲基化在PCa中的发生率分别为30%、25%和65%。非恶性病变(BPH和HGPIN)很少发生DNA过甲基化。结论:PCa的发生及进展与E-钙粘素、p16和ER基因过甲基化密切相关,检测甲基化状况对HGPIN与PCa的鉴别诊断可能有辅助作用。E-钙粘素和ER基因过甲基化可能提示预后差。

胃肠道间质细胞瘤p16基因表达与增殖、凋亡的关系

目的 研究胃肠道间质细胞瘤 (GIST)中 p16基因表达与增殖、凋亡的关系[1] 。方法 我们研究了 86例GIST ,采用免疫组织化学法检测p16基因表达 ,采用胶银及免疫组织化学法检测核仁组成区嗜银蛋白 (AgNORs)、增殖细胞核抗原 (PCNA)、抗人增殖细胞抗体Ki 6 7(Ki 6 7)来反映细胞的增殖 ,采用原位末端标记法检测细胞凋亡指数(APl)来反映细胞的凋亡。结果 p16阳性、阴性表达组的AgNORs、PCNA、Ki 6 7表达分别为 3.6 8± 1.78、6 .5 6± 1.82 (P <0 .0 1)、11.37± 6 .2 6、2 2 .13± 8.73(P <0 .0 1)、3.2 5± 2 .4 7、7.74± 3.0 5 (P <0 .0 1) ;p16阳性、阴性表达组的APl分别为 14 .92± 6 .84、7.78± 3.91(P <0 .0 1)。结论 p16基因具有明显的抑制增殖、促进凋亡的作用 ,进而影响GIST的发生、发展。

急性白血病p16基因微卫星不稳定性及杂和性缺失的研究

目的分析急性白血病(AL)患者p16基因连锁的微卫星不稳定性(MSI)和杂和性缺失(LOH),了解p16基因改变与AL发生的关系。方法采用多重PCR方法检测53例AL患者骨髓及口腔黏膜细胞标本的p16基因连锁的3个微卫星位点(D9Sl62、D9S1748、D9S171),观察其MSI及LOH情况。结果53例AL患者中,MSI检出率为43.4%(23/53);位于9p21的p16基因连锁的微卫星D9Sl62、D9S1748、D9S171的LOH发生率分别为0(0/53)、5.7%(3/53)和9.4%(5/53),MSI发生率分别为13.2%(7/53)、7.6%(4/53)和7.6%(4/53)。结论AL患者p16基因连锁微卫星均可检测到高频率的MSI和LOH,说明p16基因突变与AL发生、发展有关。

5氮杂脱氧胞苷对乳腺癌MCF-7细胞中抑癌基因p16 mRNA表达的影响

目的探讨5氮杂脱氧胞苷(5-aza-cdr)对乳腺癌细胞中p16基因mRNA表达的影响。方法分别用5-aza-cdr 5、10和20μmol/L处理乳腺癌细胞MCF-7,未处理的MCF-7细胞作为对照。采用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)对药物处理前后的细胞进行p16基因甲基化检测;绿色荧光染料实时反转录聚合酶链反应(SYBR GreenqRT-PCR)检测p16mRNA表达。结果在未处理的MCF-7细胞中(对照)p16基因呈完全甲基化状态,随着5-aza-cdr浓度增加,甲基化水平逐渐减弱,至5-aza-cdr 20μmol/L时p16基因甲基化状态完全被逆转;p16mRNA表达水平也随着药物剂量的递增逐渐增加,5-aza-cdr 20μmol/L处理组与5、10μmol/L处理组以及未处理组比较差异均有统计学意义(均P<0.01)。结论乳腺癌细胞MCF-7中p16基因的甲基化能被5-aza-cdr逆转,去甲基化后可以促进p16mRNA表达。

MAD2和p16在大肠癌中的表达及意义

目的了解大肠癌中MAD2和p16的表达,探寻在大肠癌、腺瘤及正常大肠黏膜组织中的表达差异,初步分析其临床意义。方法通过实时荧光定量PCR和免疫组织化学方法检测大肠癌、腺瘤及正常大肠黏膜组织中MAD2表达,并对大肠癌组织中MAD2扩增产物进行测序。同时利用免疫组织化学方法检测大肠癌和正常组织中p16的表达。结果大肠癌组织中MAD2的阳性表达明显高于腺瘤和正常大肠黏膜组织(66.7%vs.39.6%vs.22.9%),三者比较差异有统计学意义(P<0.001)。MAD2表达与肿瘤分化和无瘤生存时间有关(P<0.05)。大肠癌组织中未见MAD2基因突变。正常大肠黏膜组织中p16阳性表达率为16.7%,大肠癌中阳性表达率为47.9%,两者比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论基因MAD2和p16表达异常是大肠癌产生的机制之一,与大肠癌的发生及发展有关。MAD2可能是大肠癌预后的一种重要预测指标。

宫颈癌p16基因甲基化研究新方法

目的建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测宫颈癌p16基因甲基化的方法,以期达到早期诊断宫颈癌。方法正常基因组DNA经修饰后进行PCR,构建含有DNA甲基化β-actin的重组质粒,克隆阳性质粒作为标准品用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR进行检测,建立检测的标准曲线。利用建立好的方法进行检测临床60例宫颈癌组织中p16基因启动子区域5’CpG岛甲基化状态。结果结果显示正常对照组织及癌旁p16基因无甲基化,60例宫颈癌标本的甲基化率为28.33%(17/60)。结论SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR用于p16基因甲基化检测为宫颈癌的早期诊断提供了一种有效的方法。

宫颈癌中p16基因启动子异常甲基化的检测

目的:探讨宫颈癌组织及外周血浆中p16基因启动子异常甲基化的状况及其在宫颈癌诊断中的价值。方法:用甲基化特异性PCR技术对宫颈癌组织,正常宫颈组织及相对应血浆中p16基因进行甲基化的检测。结果:45例宫颈癌组织中p16基因异常甲基化率为33.3%(15/45),相对应血浆中p16基因甲基化的检出率为20%(9/45),而正常对照组织未检出甲基化。血浆中甲基化的改变与宫颈癌组织甲基化状态显著相关(P<0.05)。p16基因甲基化发生率与年龄、病理分级、临床分期之间无统计学相关性(P>0.05)。结论:p16基因CpG岛甲基化是宫颈癌发生的高频事件,其甲基化检测在宫颈癌早期诊断中有一定的应用价值。

非霍奇金淋巴瘤中p16基因突变与MSI的关系

目的研究p16基因突变与微卫星不稳定性(Microsatellite instability MSI)在非霍奇金淋巴瘤(NonHodgkin’s lymphoma NHL)发生发展中的作用,探讨p16基因内外显子1、2(exon1、exon2)的分子遗传学改变与非霍奇金淋巴瘤的关系。方法采用PCR-SSCP法对40例已确诊NHL进行p16基因外显子1、2的突变研究;选取p16基因内部微卫星位点D9S265,D9S259,D9S161,D9S169对MSI进行检测。结果 40例NHL中,P16基因总突变率为35.0%(14/40),位点D9S161、D9S259的MSI组的P16的突变率明显高于MSI阴性组,而D9S265和D9S169则与之相反(P>0.05),D9S259、D9S161、D9S265外显子2的突变和缺失率均高于外显子1。结论①NHL中存在较高p16基因突变率和MSI,提示其突变和MSI可能参与NHL的发生、发展;②通过统计分析,微卫星位点的MSI主要影响p16基因外显子2的突变和缺失;③微卫星位点D9S161和D9S169与p16基因的关系较紧密。

胰腺癌组织中p16基因缺失及其对p16蛋白表达的影响

目的 探讨胰腺癌组织中p16基因缺失状态及其对p16蛋白表达的影响。方法 采用聚合酶链反应技术分别检测经显微切割方法获取的p16蛋白免疫组化染色阳性和阴性的胰腺癌组织中p16基因纯合性缺失状态并将结果与p16蛋白表达之间的关系进行分析。结果 32例胰腺癌中分别有20例（62．5％）和21例（65．6％）表现为p16蛋白表达丢失和p16基因纯合性缺失，其中有5例发生于p16基因的第1外显子，12例缺失发生于第2外显子，1例发生于第3外显子，另有3例同时发生于第1和第2外显子。此外还发现无p16蛋白表达的胰腺癌组织发生p16基因纯合性缺失的比例（18／20，90．0％）高于有p16蛋白表达的胰腺癌（3／12，25．0％）；在无p16蛋白表达并伴有p16基因缺失的7例胰腺癌病人中仅有1例生存期超过5mo，而二者均无异常的3例胰腺癌的生存期均超过8mo。结论 胰腺癌组织中的p16基因纯合性缺失可以影响p16蛋白的表达，促使胰腺癌病人的预后更差。

肝癌患者p16基因甲基化与DNMTs表达相关性分析

目的:研究p16基因启动子区域异常甲基化所导致的基因表达异常在肝癌形成过程中的作用,探讨p16基因甲基化与DNMTs(DNMT1、DNMT2、DNMT3A和DNMT3B)表达之间的相关性。方法:检测肝癌患者癌组织、癌旁组织和肝硬化组织中p16基因的异常甲基化状态及p16、DNMTs基因mRNA的表达水平;采用甲基化特异性PCR技术检测甲基化状态,荧光定量技术检测mRNA的表达。结果:p16基因在肝癌组织、肝硬化组织和癌旁组织中的甲基化率分别为70.5%(31/44)、37.1%(13/35)和9.1%(4/44),肝癌组织和肝硬化组织中的甲基化改变与癌旁组织比较差异有统计学意义,P<0.01。31例甲基化阳性组织中17例p16基因表达降低或缺失,13例甲基化阴性组织中2例基因表达降低或缺失,甲基化阳性与阴性的p16基因表达水平存在明显差异。癌组织和肝硬化组织中4种DNMT mRNA水平均高于相应癌旁组织。其中DNMT1、DNMT3A和DNMT3BmRNA的表达水平差异有统计学意义,DNMT1:P值分别为0.009和0.020;DNMT3A:P值分别为0.005和0.010;DNMT3B:P值分别为0.039和0.036。DNMT2mRNA的表达水平虽然高于相应癌旁组织,但差异无统计学意义,P值分别为0.120和0.350。DNMT1、DNMT 3A和DNMT3B的表达与p16甲基化有相关性,P值分别为0.013、0.025和0.041。结论:p16基因甲基化是肝癌的早期、频发事件,其改变是其基因表达下降甚至失活的重要原因。DNMTs活性的改变可能促进p16基因的异常甲基化。

宫内膜细胞p16基因表达检测筛查子宫内膜癌的研究

目的研究良性病变子宫内膜细胞与子宫内膜癌细胞中p16基因的表达,探讨p16基因表达检测筛查子宫内膜癌的可行性及临床应用价值。方法使用子宫内膜细胞采集器采集子宫内膜细胞,采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(Real-time Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)检测51例子宫内膜细胞标本中的p16基因mRNA,其中良性病变子宫内膜细胞16例,子宫内膜癌细胞35例,比较两者间基因表达的差异;统计p16基因表达检测筛查子宫内膜癌的敏感性和特异性。结果 16例良性病变子宫内膜细胞标本p16基因mRNA水平显著高于35例子宫内膜癌细胞标本(P=0.027),宫腔细胞p16基因表达检测诊断子宫内膜癌的敏感性为73.7%,特异性为78.9%。结论宫内膜细胞p16基因表达检测适用于门诊及大规模子宫内膜癌的筛查,尤其适用于症状人群及高危人群的常规筛查。

P16^INK4a在原发性系膜增生性肾小球肾炎的表达及临床意义

目的探讨原发性系膜增生性肾小球肾炎活检肾组织（MsPGN）细胞周期素依赖蛋白激酶抑制剂P16^INK4a在肾组织的表达及其与固有细胞增生、硬化的关系，结合临床参数分析，为延缓慢性肾脏病进展开辟新的途径。方法采用非生物素免疫组化二步法检测36例MsPGN患者肾活检组织和6例外伤肾切除石蜡包埋肾组织中肾小球和肾小管间质P16^INK4a的表达水平，并结合临床资料进行分析。结果（1）MsPGN组肾小球和小管间质P16^INK4a表达升高，与对照组相比，差异有统计学意义（P〈0．01）。36例中15例硬化、新月体形成组肾小球上高表达，而非硬化、非新月体形成组肾小球上仅部分表达，组间相比差异有统计学意义（P〈0．01），小管间质表达差异无统计学意义（P〉0．05）。（2）36例MsPGN组中肾小球P16^INK4a表达与未使用类固醇激素／免疫抑制剂、未使用ACEI／ARB正相关（r=0．774、0．497，P〈0．01），BP、Scr水平与P16^INK4a呈正相关（r=0．64、0．473，P〈0．01），Ccr、TMP与P16^INK4a呈负相关（r=-0．487、-0．694，P〈0．01），而小管间质表达与临床资料不相关。结论P16^INK4a可能起促进异常增殖的肾固有细胞消退作用，并诱导肾脏衰老导致肾小球硬化、新月体形成；P16^INK4a表达不仅反映肾功能损伤程度，也间接反映BP和蛋白尿水平；药物干预可影响P16^INK4a的表达。

非小细胞肺癌患者呼出气冷凝液和肿瘤组织中p16基因突变的研究

目的研究呼出气冷凝液（EBC）和肺癌组织中p16基因突变，探讨EBC中检测的可行性和临床意义。方法收集30例非小细胞肺癌（NSCLC）患者的肺癌组织和EBC标本，同期20名健康体检者的EBC标本作为对照。提取NSCLC患者手术切除的肺癌组织中的DNA，对β-actin基因片段扩增阳性的EBC标本和已提取的肺癌组织DNA进行p16基因1、2、3号外显子PCR扩增，并进行DNA基因测序，用DNASTAR软件进行突变比对，结果进行统计学分析。结果①30例NSCLC患者的EBC中β-actin基因片段扩增阳性26例，26例中有9例检出p16基因突变，突变率为34．6％；EBC中检出p16基因突变患者，其肺癌组织中均发现p16基因突变。②30例NSCＬC癌组织中检测到p16基因突变15例，突变率为50．0％；癌旁组织均未检测到p16基因突变。③9例NSCLC患者EBC中p16基因突变的外显子为1号外显子3例，2号外显子5例，3号外显子1例；15例NSCLC患者肿瘤组织中p16基因突变的外湿子为1号外显子4例，2号外显子8例，3号外显子3例。④26例NSCLC患者EBC中G－actin基因扩增阳性，Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ期患者p16基因突变率分别为25．0％（3／12）、28．6％（2／7）和57．1％（4／7）（P〉0．05）；鳞癌和腺癌患者的p16基因突变率分别为42．90．4（6／14）和25．0％（3／12）（P〉0．05）。⑤同一患者EBC与肺癌组织中p16基因突变的外显子种类、突变方式、突变类型和密码子均相同。结论肺癌患者EBC和癌组织中均能检测到p16基因突变，并有高度的一致性。EBC中p16基因突变检测可作为一种简便、快速的肺癌诊断方法。