VEGF121和BMP2双基因共表达重组腺病毒载体的构建及其在HEK293中的表达

目的构建人血管内皮生长因子121(VEGF121)与人骨形态发生蛋白2(BMP2)双基因共表达腺病毒载体Adv-BMP2-IRES-VEGF121,并观察其在人胚肾细胞株(HEK293)中的表达情况。方法对腺病毒质粒pShuttle-CMV-BMP2的目的基因BMP2进行PCR扩增。腺病毒质粒pShuttle-CMV-VEGF121-IRES-hrGFP-1经Kpn I/Xba I酶切后,将BMP2片段定向导入pShuttle-CMV-VEGF121-IRES,构建pShuttle-CMV-V EGF121-IRES-BMP2,并注入大肠杆菌DH5a中扩增,提取质粒。通过酶切分析、PCR检测和序列分析进行鉴定。将构建所得的质粒转染HEK293,采用RT-PCR法检测HEK293中的BMP2、VEGF121 mRNA,Western blot法检测其蛋白。结果成功构建了Adv-BMP2-IRES-VEGF121。酶切分析及DNA序列测定证实重组质粒构建正确。质粒转染后的HEK293 BMP2和VEGF121表达阳性。结论成功构建了Adv-BMP2-IRES-VEGF121,其转染HEK293后,VEGF121、BMP2在HEK293中共表达阳性。

GFP示踪FLAG抗原表位标记BMP2转基因腺病毒穿梭质粒的构建

目的构建同时表达具有抗原表位FLAG标记的重组人骨形态发生蛋白2(rhBMP2)目的蛋白和示踪绿色荧光蛋白(GFP)报告分子的腺病毒穿梭质粒pShuttle CMV-BMP2+-IRES-hrGFP-1。方法采用PCR技术对pcDNA3-BMP2携带的BMP2基因诱变,去除翻译终止密码子后的基因序列并添加新的酶切识别位点XhoⅠ。测序检测诱变情况,将诱变后的BMP2基因定向导入pShuttle CMV-IRES-hrGFP-1,将质粒分别转染人胚肾细胞HEK293A和兔骨髓间充质干细胞(MSCs)。通过限制性内切酶酶切图谱分析该质粒;采用荧光显微镜检查和免疫组化SP法测定HEK293A中的GFP和MSCs中的BMP2,行重组腺病毒穿梭质粒鉴定。结果质粒pShuttle CMV-BMP2+-IRES-hrGFP-1经双酶切鉴定图谱分析构建正确,HEK293A、MSCs中均有GFP和BMP2表达。结论 pShuttle CMV-BMP2+-IRES-hrGFP-1构建成功。

重组基质细胞衍生因子1α对单核细胞的趋化作用

目的探讨pcDNA3.1-基质细胞衍生因子1α重组质粒对单核细胞的趋化作用。方法将pcDNA3.1-基质细胞衍生因子1α质粒用脂质体的方法导入人脐静脉内皮细胞株ECV304细胞中,G418筛选细胞克隆。通过逆转录聚合酶链反应法在转录水平检测基质细胞衍生因子1α在转基因ECV304细胞中的表达。通过Transwell实验研究基质细胞衍生因子1α对单核细胞的趋化作用。结果获得了稳定表达基质细胞衍生因子1α基因的ECV304细胞克隆,pcDNA3.1-基质细胞衍生因子1α重组质粒对单核细胞具有趋化作用。结论重组大鼠基质细胞衍生因子1α对单核细胞具有明显的趋化作用。

小鼠STAT4、STAT6基因克隆及其真核表达质粒的构建

目的:分别克隆小鼠信号传导及转录活化因子-4(Signal transducers and activators of transcription-4,STAT4)、信号传导及转录活化因子-6(Signal transducers and activators of transcription-6,STAT6)基因全长cDNA序列,构建并鉴定其真核表达质粒pIRES2-EGFP-STAT4/STAT6。方法:采用RT-PCR方法从BALB/c小鼠脾脏组织中扩增STAT4/STAT6基因全长cDNA,T/A克隆到pMD19-T载体中,双酶切后将cDNA亚克隆入pIRES2-EGFP载体,构建pIRES2-EGFP-STAT4/STAT6质粒,经限制性内切酶鉴定并测序。结果:小鼠STAT4/STAT6基因cDNA正确克隆入pIRES2-EGFP表达载体,与Genebank中STAT4/STAT6基因序列一致。结论:成功构建pIRES2-EGFP-STAT4/STAT6表达质粒,为进一步研究STAT4/STAT6蛋白表达和相互作用奠定了基础。

乙型肝炎表面抗原与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子融合表达质粒诱导小鼠特异性免疫应答

目的 观察乙型肝炎表面抗原(HBsAg)与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM CSF)融合表达质粒诱导特异性免疫应答的效果。方法 以HBsAg与GM-CSF融合表达质粒DNA免疫BALB/C小鼠,用酶链免疫吸附方法检测质粒诱导BALB/C小鼠产生抗HBs及脾细胞经HBsAg体外刺激后分泌白细胞介素(IL)-2、4及γ干扰素(IFNγ)的水平;并用^(21)Cr释放法检测HHsAg特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应。结果 各组小鼠加强免疫后血清抗体水平(P/N值)A组(PcDNA3.1-S)16.1+20.3,B组(PcDNA3.1 GM-CSF-S)28.3±19.7,F组(重组酵母乙型肝炎疫苗)29.5±21.5,C组(PcDNA3.1S-GM-CSF)0.3±0.0,D组(PcDNA3.1—S+PcDNA3.1-GM-CSF)4.5+5.9,E组(PcDNA3.1—GM-CSF)0.9±1.2,G组(PcDNA3.1)及H组(PBS)为阴性(F-4.176,P<0.01);IL-2分泌水平A组(26.6±1.9)、B组(56.0±2.2)、C组(4.3±1.2)、D组(33.5±1.7)、F组(3.5+1.4)、F组(7.5±2.0)、G组(1.5±0.7),H组未检测到IL-2分泌(F=31.188,P<0.01);IFN-γ分泌水平A组(64.0±7.5)、B组(139.0±17.0)、C组(11.0±5.0)、D组(53.0±9.5)、E组(9.0±3.0)、F组(13.0±2.0)、G组(8.0±2.0,P(0.05),H组未检测到IFN—γ泌(F=31.796,P<0.01);HBsAg特异性CTL活性,效靶比为30:1及10:1时各组音有差异有显著性(F值分别为26.891。