PMCA1-4及其A端和C端剪接变异体在成年大鼠前庭组织中的表达

目的研究质膜钙ATP酶异构体1-4(plasma membrane Ca^(2+)-ATPase 1-4,PMCA1-4)在成年大鼠前庭组织的分布部位,及其A端和C端剪接变异体的表达类型。方法选择8周龄健康SD大鼠,解剖出内耳器官行前庭切片,同时取前庭椭圆囊斑和球囊斑提取总RNA。通过免疫荧光方法检测PMCA1-4在成年大鼠内耳前庭组织的表达部位,通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测PMCA1-4的A端和C端剪接变异体在成年大鼠前庭组织的表达类型。结果球囊和椭圆囊荧光染色切片中,于毛细胞和支持细胞的胞体外侧膜可见PMCA1表达,毛细胞纤毛中可见PMCA2强表达,毛细胞和支持细胞的胞体外侧膜可见PMCA3弱表达,PMCA4几乎不表达。4种PMCA亚型在球囊表达的剪接体分别为PMCA1x/b、PMCA2w/b、PMCA3z/(a,b)和PMCA4x/b,它们在椭圆囊的表达类型与球囊相同。结论PMCA1-4在成年大鼠前庭器官的表达部位存在差异,这4种PMCA亚型的剪接体类型也各不相同。这种差异性可能是为了满足前庭组织和亚细胞结构域对Ca2+调节的特殊需求。

质膜钙ATP酶异构体1～3在新生大鼠耳蜗基底膜的表达

目的通过Western blot方法检测质膜钙ATP酶异构体1～3（plasma membrane Ca2＋-ATPase isoforms 1～3,PMCA1～3）在新生大鼠耳蜗基底膜（basilar membrane,BM）的表达,并检测PMCA2在单个新生大鼠耳蜗毛细胞纤毛的表达量。方法 1取出生后2天（P2）和8天（P8）健康SD大鼠各4只,断头后分离出BM,提取总蛋白,分别取20μg,通过Western blot法检测BM的PMCA1～3表达。2取P2和P8大鼠BM总蛋白3μg,通过Western blot方法检测BM的PMCA2的表达。3取4只P8大鼠,分离出BM,提取总蛋白,分别取5、10、20μg总蛋白并取100、400和800ng牛血清白蛋白（BSA）作为对照组,跑完电泳后将胶分为2部分,部分泳道用于SYPRO染胶,其余泳道用于Western blot检测PMCA2的表达。结果 1在20μg的P2和P8大鼠BM总蛋白中,PMCA1仅有微弱的表达（分别为0.126±0.024、0.131±0.012）,PMCA2表达水平较高（分别为4.16±0.528、4.25±0.319）,PMCA3几乎没有表达（均为0）,三者间差异有统计学意义（P〈0.05）。2在3μg的P2和P8大鼠BM总蛋白中,P8大鼠PMCA2的表达水平（4.571±0.336）高于P2大鼠（3.622±0.285）,差异有统计学意义（P〈0.05）。3PMCA2在单个P8大鼠BM的含量约为2.5ng。结论 PMCA1～3在新生大鼠耳蜗BM的表达水平不同,PMCA2表达量最大,这可能是由于耳蜗毛细胞对这几种PMCA亚型有不同的Ca2＋调节需求。

脑缺血后ET-1和SPM、Mit Na^+-K^+-ATP酶的变化

应用兔大脑中动脉阻断模型，分离出突触膜（synapticplasmamembrane，SPM），线粒体（mitochondria，Mit）并测其Na+－K+－ATP酶活性，同时以放免法测定脑组织内皮素－1（ET－1）含量。结果发现脑缺血后脑组织ET－1含量显著增加，SPM、MitNa+－K+－ATP酶活性下降，两者呈显著负相关（r1＝－0．9776，P＜0．05；r2＝－0．9980，P＜0．02）．提示ET－1在脑缺血脑水肿中的作用可能与其抑制Na+－K－－ATP酶活性有关。

氧化锌抑制紫外线B诱导的人晶状体上皮细胞Ca^2＋-ATP酶1表达

目的研究纳米材料氧化锌在有/无紫外线B(ultraviolet B,UVB)照射下对人晶状体上皮细胞系B-3(human lens epithelial cell B-3,HLEB-3)细胞质膜 ma membrane calcium ATPase1,PMCA1)表达的影响。方法HLEB-3细胞进行培养和传代,在有/无UVB照射情况下,加入不同浓度的氧化锌,利用DAPI染色细胞核;Annexin V/PI染色检测细胞凋亡;Fluo-3/AM染色检测细胞内Ca2+浓度的变化;实时荧光定量PCR检测PMCA1 mRNA表达水平;Western blot方法检测PMCA1蛋白表达水平。结果DAPI细胞核染色结果显示,氧化锌以浓度依赖方式使HLEB-3细胞产生典型的细胞凋亡反应;UVB照射可增加氧化锌对HLEB-3细胞的毒性效应;在UVB照射下,经氧化锌(2.5μg·m L^(-1)1、5.0μg·m L^(-1)、10.0μg·m L^(-1))处理的HLEB-3细胞凋亡及细胞内Ca2+浓度增加(均为P<0.05),细胞内Ca2+水平分别从(156.34±4.59)nmol·L^(-1)增加到(173.88±7.17)nmol·L^(-1)、(289.02±9.09)nmol·L^(-1)、(488.36±48.16)nmol·L^(-1),差异均有统计学意义(均为P<0.05);在无UVB照射下,2.5μg·m L^(-1)、5.0μg·m L^(-1)、10.0μg·m L^(-1)氧化锌组细胞PMCA1 mRNA表达分别是0μg·m L^(-1)氧化锌组的0.75倍、0.57倍和0.41倍,差异均有统计学意义(均为P<0.05);而在有UVB照射下,各浓度氧化锌组细胞PMCA1 mRNA表达分别是0μg·m L^(-1)氧化锌组的0.64倍、0.24倍和0.09倍,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论氧化锌和UVB照射通过Ca^(2+)信号转导通路对HLEB-3细胞有协同抑制作用,提示氧化锌在有UVB照射的情况下对后发性白内障的治疗有巨大潜在作用。

质膜钙ATP酶异构体1～4的剪接体在新生大鼠前庭器官的表达

目的研究质膜钙ATP酶异构体(plasma membrane Ca^(2+)-ATPase isoforms,PMCAs)1~4(PMCA1~4)的A端和C端剪接变异体在新生大鼠前庭器官的表达。方法取出生2天的健康SD大鼠10只,断头后分离出前庭器官(椭圆囊斑和球囊斑),提取总RNA,通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法,检测PMCA1~4的A端和C端剪接变异体的表达。结果在新生大鼠的椭圆囊斑和球囊斑PMCA1~4表达的剪接体分别为PMCA1x/b,PMCA2w/(a、b),PMCA3z/(a、b、c)和PMCA4(x、z)/b。结论在新生大鼠前庭器官,PMCA1、PMCA2、PMCA3和PMCA4之间表达的A端和C端剪接变异体类型均不同,这可能是由于椭圆囊斑和球囊斑对这些PMCA亚型有着不同的Ca2+调节需求。

沉默PMR1表达促进胰岛细胞分泌胰岛素的研究

目的利用RNA干扰技术(RNAi)研究体外合成的siRNA分子对高尔基体膜上钙离子ATP酶1(plasma membrane-relatedCa2+-ATPase-1,PMR1)的基因沉默作用,并探讨沉默后对胰岛细胞分泌胰岛素的影响。方法委托公司合成抗PMR1基因的siPMR1,用脂质体方法介导siPMR1转染胰岛NIT-1细胞,采用RT-PCR法观察siPMR1转染前后胰岛细胞中PMR1mRNA的表达变化,并用放射免疫分析法测定胰岛细胞分泌的胰岛素浓度。结果siPMR1转染胰岛NIT-1细胞后能明显抑制PMR1mRNA表达,siPMR1转染的胰岛NIT-1细胞能显著增加胰岛素分泌量。结论siPMR1可明显沉默PMR1基因表达,并促进胰岛细胞分泌胰岛素,为用RNAi技术沉默PMR1靶点治疗糖尿病提供了理论基础。

左归丸对去势大鼠钙转运通路相关蛋白的影响

目的:探讨左归丸对去势大鼠骨密度和骨组织中钙转运通路相关蛋白的影响。方法:选取48只雌性SD大鼠,随机分为正常组,假手术组,模型组,尼尔雌醇组(0.167 mg·kg^-1),左归丸低、高剂量组(9.6,38.4 g·kg^-1)。除假手术组和正常组,其余组切除大鼠卵巢,造模成功后3个月进行各组干预。3个月后处死大鼠,检测大鼠骨密度(BMD)和骨代谢标志物;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测钙转运通路(骨组织)瞬时受体电位通道V5(TRPV5),钙结合蛋白-D28K(CaBP-D28K),钠钙交换器1(NCX1)和细胞膜钙汞(PMCA1b)蛋白表达。结果:与正常组比较,模型组血钙降低(P<0.01),与模型组比较,左归丸高剂量组和尼尔雌醇组大鼠血钙显著升高(P<0.01);与正常组比较,模型组BMD显著降低(P<0.01),与模型组比较,左归丸高剂量组与尼尔雌醇组大鼠BMD均有改善(P<0.05);与假手术组和正常组比较,模型组各蛋白表达均有不同程度上调(P<0.05,P<0.01),与模型组比较,左归丸高剂量组中TRPV5蛋白表达有显著下调(P<0.01),各干预组中的CaBP-D28K与NCX1蛋白表达均有不同程度的下调(P<0.05,P<0.01),PMCA1b蛋白表达在左归丸低剂量组和尼尔雌醇组内表达均有不同程度下调(P<0.05,P<0.01)。结论:左归丸可不同程度的降低大鼠破骨细胞中TRPV5,CAPB-D28K,PMCA1b,NCX1等介导破骨细胞吸收钙离子的重要通道蛋白的表达,左归丸的抗骨质疏松机理有可能是通过抑制TRPV5介导的破骨细胞的骨吸收而起作用。