人脂联素球型结构域原核表达重组质粒的构建及体外表达

目的通过分子克隆表达人脂联素基因球型结构域(gAd),为进一步研究提供实验基础。方法应用RT-PCR方法从人大网膜脂肪组织总RNA中扩增出gAd cDNA,克隆入载体pMD18-T、pET32a(+)中,形成重组质粒gAd-pET32a(+)。筛选出阳性克隆,通过限制性内切酶酶切、PCR和测序进行鉴定,并在体外进行小量表达。结果从脂肪组织总RNA中扩增得到412 bp片段gAd基因,其cDNA序列与GenBank人gAd基因序列相同,并在体外表达得到相对分子质量为34 000的重组蛋白。结论成功构建了gAd基因原核表达质粒并实现体外的小量表达。

大肠杆菌ybfE基因的三种原核质粒表达水平的对比及蛋白纯化

[目的]构建大肠杆菌功能未知基因ybf E的pET16b、pET32a和p GEX-4T-1三种原核表达系统,通过对比表达水平筛选出最优表达体系,并纯化表达的可溶性Ybf E融合蛋白。[方法]使用pET16b、pET32a和p GEX-4T-1表达质粒构建pET16b-ybf E、pET32a-ybf E和p GEX-4T-1-ybf E原核表达载体,分别转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达Ybf E融合蛋白,对三种表达系统的表达水平进行对比,并对pET16b-ybf E和pGEX-4T-1-ybf E表达体系的裂菌上清中的可溶性Ybf E融合蛋白液分别使用镍柱和GST蛋白纯化柱纯化。[结果]构建了pET16b-ybf E、pET32a-ybf E和p GEX-4T-1-ybf E原核表达体系,并使用IPTG诱导表达Ybf E融合蛋白。ybf E在p GEX-4T-1载体内的表达水平最高,接下来依次为pET16b和pET32a。pET16b-ybf E和p GEX-4T-1-ybf E表达的可溶性Ybf E融合蛋白纯化后浓度分别为86μg/m L和724μg/m L。[结论]成功构建了ybf E基因的三种原核表达系统,筛选出最佳表达体系,可溶性Ybf E融合蛋白得到纯化。