pEGFP-C1/U6质粒载体介导的表达MDR1shRNA的质粒构建

为了构建pEGFP-C1/U6载体介导MDR1短发卡RNA(shorthairpinRNA,shRNA)表达的质粒,针对MDR1的19碱基大小的片段,分别设计2对寡核苷酸,形成双链后将其依次连入带有U6启动子的pEGFP-C1载体(命名为pEGFP-C1/U6),两对DNA双链连接后形成中间由9个碱基序列间隔的反向互补序列,构建成能产生MDR1短发卡RNA的质粒。结果表明:经酶切、连接后构建成的质粒(pEGFP-C1/U6/A和pEGFP-C1/U6/B),经酶切与测序证实构建成功,无任何碱基突变。结论:成功构建了能表达MDR1shRNA的质粒载体pEGFP-C1/U6/A和pEGFP-C1/U6/B,此项研究结果可能为临床上逆转肿瘤多药耐药提供一种有效的方法。

pcDNA3-hNGFb真核表达载体的构建及其表达

目的构建人神经生长因子β(NGF-β)基因真核表达载体并观察其在L929细胞内的表达。方法以RT-PCR从人脑组织总RNA中扩增NGF-βcDNA,将其克隆到真核表达载体pcD-NA3中,经酶切鉴定和序列分析后,以Lipofectamine2000介导转染L929细胞,应用免疫细胞化学和western blot鉴定NGF-β在细胞内的表达。结果RT-PCR产物为750bp的特异片段,重组质粒pcDNA3-hNGFb酶切后产生750bp和5.2kb的片段,DNA测序证实750bp片段的碱基序列与人NGF-βcDNA完全一致。将其转染L929细胞后,免疫细胞化学、western blot结果表明NGF-β及其前体proNGF-β能在真核细胞中正确表达。结论成功构建了重组真核表达质粒pcDNA3-hNGFb,为后续的研究奠定基础。

COL1A1-shRNA表达质粒构建及抑制COL1A1表达的有效序列的筛选

目的:构建和筛选对大鼠肝星状细胞前Ⅰ型胶原α1链(COL1A1)mRNA有抑制作用的COL1A1短发夹RNA(shRNA)的表达质粒.方法:从NCBI网站获得大鼠的COL1A1cDNA序列,根据Whitehead研究所的siRNA设计软件设计3条理论上最佳的siRNA序列,相应的双链DNA被插入pGPU6/GFP/Neo质粒中,即pGPU6/GFP/Neo-shRNA-A、pGPU6/GFP/Neo-shRNA-B和pGPU6/GFP/Neo-shRNA-C.为得到高效沉默COL1A1-siRNA,以脂质体LipofectAMINE2000,将1、2、3、4μgDNA质粒转染至HSC-T6细胞中,并观察转染效果.将最佳沉默siRNA导入HSC-T6细胞,RT-PCR分析各组的COL1A1mRNA表达水平.结果:靶向COL1A1mRNA的3个shRNA重组质粒载体pGPU6/GFP/Neo-shRNA-A、pGPU6/GFP/Neo-shRNA-B和pGPU6/GFP/Neo-shRNA-C经测序分析,shRNA编码序列与设计的片段完全一致,经酶切凝胶电泳证实载体构建成功.1、2、3、4μg组转染效率分别为16.7%、20.3%、23.5%和22.3%,以2μgsiRNA为最佳剂量,pGPU6/GFP/Neo-shRNA-A、pGPU6/GFP/Neo-shRNA-B和pGPU6/GFP/Neo-shRNA-C对COL1A1 mRNA的抑制率分别为16.6%,63.3%和80.3%.结论:筛选出的pGPU6/GFP/Neo-shRNA-C表达质粒能高效地抑制转染细胞COL1A1mRNA的表达,从而为肝纤维治疗提供新的方法和材料.

庆大霉素耐药质粒的检测及P1Gm噬菌体的分离

本文检测邯郸、福州两地１４９株新生儿胎便中肠道杆菌的耐药率、ＭＩＣ、耐药质位及其消除率。结果表明庆大霉素（Ｇｍ）耐药基因主要位于耐药质粒上；Ｇｍ耐药质粒较稳定、宿主范围较广。此外，本文获得８株ＰＩＣｍｃｌ（ｔｓ）１００与Ｇｍ耐药质粒形成的类似于Ｐ１Ｃｍ性质而由Ｇｍ取代Ｃｍ基因的Ｐ１Ｇｍｃｌ（ｔｓ）１００。Ｐ１Ｃｍ或Ｐ１Ｇｍ可感染９种肠道杆菌。

人乳头瘤病毒16型E＿6E＿7基因反义质粒对人宫颈癌细胞恶性的逆转作用

构建可为地塞米松诱导表达的人乳头瘤病毒１６型（ＨＰＶ－１６）Ｅ＿６Ｅ＿７基因反义质粒（ｐ１６ａｓＥ＿６Ｅ＿７Ｎｅｏ），利用磷酸钙沉淀法将其分别转染到ＨＰＶ－１６阳性的人宫颈癌细胞株Ｃａｓｋｉ和ＨＰＶ阴性的人宫颈癌细胞株Ｃ－３３Ａ中。地塞米松诱导反义质粒表达后，ＣａｓＫｉ细胞失去其恶性表型，而Ｃ－３３Ａ细胞的生长特性及恶性行为未发生变化。说明反义质粒能够改变Ｃａｓｋｉ细胞的恶性表型，且这种改变是通过特异性抑制Ｅ＿６Ｅ＿７基因表达实现的。

pp32在前列腺癌细胞中的作用研究

目的研究pp32在前列腺癌细胞中的作用。方法将本实验室先前保存的pcDNA3.1和pcDNA3.1-pp32质粒,转染至Pc3M细胞,构建Pc3M-pp32稳定细胞株。吉姆萨染色实验观察Pc3M细胞的形态变化,通过Transwell小室法检测细胞迁移能力。黏附测定实验鉴定细胞的黏附能力,采用MTT法测定细胞生长曲线。最后,Western印迹检测N-钙黏蛋白(N-cadherin)在细胞中的表达。结果成功筛选并获得了稳定过表达pp32的细胞株(Pc3M-pp32),pp32能引起Pc3M细胞形状的显著改变,引起人前列腺癌细胞Pc3M迁移和黏附能力的增加,明显促进Pc3M细胞的生长,并有效抑制N-钙黏蛋白在Pc3M细胞中的表达。结论过表达pp32可引起Pc3M细胞的形状改变,并可促进Pc3M细胞的迁移、黏附以及生长。

从患者胆汁分离的大肠埃希菌中质粒介导的氟喹诺酮类耐药基因的检测

目的分析浙江省衢州市开化县第二人民医院消化内科胆汁分离的大肠埃希菌的耐药特点并调查质粒介导的喹诺酮类耐药基因的分布情况和流行特点。方法收集该院消化内科患者2011年1月至2013年6月分离的大肠埃希菌724株,均为非重复性菌株,采用全自动微生物分析仪器VITEK 2 COMPACT进行细菌鉴定及药物敏感性分析,采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)分析质粒介导的氟喹诺酮类耐药基因(plasmidmediated quinolone resistance genes,PMQR)如qnr A、qnr B、qnr S、aac(6')–Ib-cr和qep A基因的流行特点。结果胆源性大肠埃希菌的构成比达18.65%(135/724),其对环丙沙星和左氧氟沙星的耐药率高达61.5%(83/135)和55.6%(75/135),未检出碳青霉烯类抗生素耐药菌株;PCR检测PM QR基因结果显示:135株胆源性大肠埃希菌中,121株(89.63%)qnr A1基因阳性,45株(33.33%)qnr B4基因阳性,32株(23.70%)qnr B6基因阳性,43株(31.85%)qnr S1基因阳性,34株(25.19%)aac(6')-Ib-cr基因阳性菌株,未检出qep A基因;其中45株(33.33%)同时携带qnr A1、qnr B4基因,32株(23.70%)同时携带qnr A1、qnr B6,25株(18.52%)同时携带qnr A1、qnr B4、qnr S1,21株(15.56%)同时携带qnr A1、qnr B4、qnr S1、acc(6')-Ib-cr,12株(100%)同时携带qnr A1、qnr B6、qnr S1、acc(6')-Ibcr,且环丙沙星和左氧氟沙星的耐药率随着PM QR基因组合种类的增多而增多。结论消化内科胆汁分离的大肠埃希菌氟喹诺酮类抗生素耐药严重,耐药基因主要以qnr A1为主,qnr B4和qnr B6次之,且存在多种PMQR基因组合形式,这些潜在播散的氟喹诺酮耐药基因对于临床胆道感染的治疗有很大的挑战。