毛果杨PLD基因家族全基因组水平鉴定及其盐胁迫下的表达分析

[目的]对木本模式植物毛果杨PLD基因家族的进化中的选择压力、启动子中顺式作用元件、组织表达特性以及盐胁迫下表达模式进行分析,为挖掘PtrPLD在非生物胁迫中作用提供参考。[方法]利用拟南芥PLD基因家族蛋白序列比对得到毛果杨基因组同源基因,再经过保守结构域鉴定后确定PtrPLD基因;利用软件ClustalW和MEGA对PtrPLD和AtPLD基因的氨基酸序列进行比对和系统进化分析;利用MEME、PlantmPLoc、 ExPasy等软件工具分析PtrPLD基因及编码蛋白的特征;利用Tbtools软件分析同源基因的Ka/Ks值;利用Plantcare在线工具分析PtrPLD启动子中顺式作用元件;利用Phytozome转录组数据库以及qRT-PCR分析PtrPLD组织表达特性;利用qRT-PCR分析各组织中PtrPLD对盐胁迫响应情况。[结果]PtrPLD家族的16个基因可分为C2-PLD和PX/PH-PLD 2个亚家族,分别包含13个和3个基因;有7对旁系同源基因且它们之间的Ka/Ks均远小于1;PtrPLD家族基因启动子区含有大量非生物胁迫和激素响应元件,其中,PtrPLDδ4启动子共含有9种、20个元件;PtrPLD家族编码的蛋白均含有Motif 1~4,且同一进化分支上的基因编码蛋白序列高度保守。PtrPLD基因家族表达特性分析表明,PtrPLD家族基因在根、茎和叶中具有表达特异性,并且多数成员主要在根部表达;NaCl胁迫下,PtrPLD家族基因在根、茎和叶中表达量在0~72 h内均表现为先上升后下降再上升的变化趋势。[结论]PtrPLD家族基因在毛果杨响应盐胁迫过程中有着重要作用,本项研究对于今后PtrPLD家族基因生物学功能的鉴定与非生物逆境胁迫响应基因资源的挖掘具有推动作用。

蒙古冰草PLD基因cDNA克隆及生物信息学分析

以蒙古冰草（Agropyron mongolicumKeng）叶片为材料。根据已报道的醉酒毒麦PLD基因片段设计特异引物,通过RT-PCR和RACE技术,获得蒙古冰草PLD基因的全长cDNA（GenBank登录号为EU333811）。该基因cDNA全长2 966 bp,包含2 439 bp的完整开放读码框,编码813个氨基酸。BlastP搜索结果显示,该基因推测的氨基酸序列与已克隆的醉酒毒麦、玉米、水稻PLD基因氨基酸序列的一致性为80%-89%。利用生物信息学软件在线分析其序列结构、氨基酸组成及编码氨基酸的性质和结构,结果表明：该基因编码的蛋白为可溶性蛋白,其相对分子量为92 079.2 Da,理论等电点为5.24,无跨膜域、无信号肽;其二级结构主要以无规卷曲为主;三级结构显示紧靠N端处为C2域,在中间和靠近C端处存在PLD的标志序列,即HKD基序。系统进化树显示,蒙古冰草PLD与醉酒毒麦的亲缘关系最近。

渗透胁迫下扁穗冰草生理变化与PLD基因的表达差异

为分析扁穗冰草(Agropyron cristatum)抗旱特性,以扁穗冰草实生苗为研究材料,进行干旱胁迫条件下脯氨酸、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)、可溶性糖生理指标的测定及用Real-time qPCR方法分析扁穗冰草PLD基因表达差异。结果表明,不同渗透胁迫条件下扁穗冰草的脯氨酸、POD和可溶性糖含量的变化以及扁穗冰草PLD基因表达量都与扁穗冰草渗透胁迫相关。

奶牛精子变形期间Pld6基因表达及蛋白序列分析

本研究旨在揭示精子线粒体鞘形成机制,提高种公牛繁殖潜力。采集3头健康状况良好、15～17月龄荷斯坦公牛睾丸和附睾组织,通过冷冻切片和激光捕获显微切割(laser capture microdissection,LCM)技术获取圆形和长形精子细胞,浮游法获取附睾尾精子,并采用TRizol法提取各样本RNA,对奶牛精子形成过程中的转录组进行差异分析和q PCR检测,利用生物信息学技术对其中Pld6蛋白结构和功能进行预测分析。结果表明,在精子形成过程中,Pld6基因在圆形～长形精子细胞发育过程中表达升高,而在成熟过程中转录降低甚至关闭。Pld6基因富集在线粒体融合(mitochondrial fusion)条目上,与精子尾部中段线粒体分布和形态结构相关,其蛋白为跨膜蛋白,第10～32位氨基酸是跨膜区域,三级结构呈喇叭状,在喇叭内部具有保守且呈β折叠的H(X) K(X4) D (HKD)酶活性结构域,与小鼠Pld6结构相似,且两者具有最接近的进化趋势。综上表明,根据小鼠研究推断牛精子变形过程中,Pld6基因表达增多可诱导线粒体向精子细胞尾部中段聚集,促进了线粒体鞘的正常形成,对确保牛精子活力及受精能力具有重要作用。

砂藓RcPLD基因的抗旱功能分析

砂藓(Racomitrium canescens)是一种具有极强耐脱水性的苔藓植物,编码磷脂酶D的基因RcPLD能够在砂藓的脱水和复水过程中产生显著的表达响应,它可能参与了砂藓的强耐脱水性功能。该研究使用已克隆的RcPLD编码序列构建拟南芥(Arabidopsis thaliana)过量表达转基因株系rcpld-oe,初步考察过表达株系的干旱胁迫耐受能力及其相关的生理生化指标,分析RcPLD增强拟南芥抗旱性的机制。结果表明:(1)利用已克隆的RcPLD编码序列构建了植物中的过表达载体,成功构建了RcPLD的过表达转基因拟南芥株系rcpld-oe,并获得了多个T3代rcpld-oe纯合体株系。(2)在正常生长条件下,rcpld-oe株系T3代纯合体植株比野生型拟南芥植株体积小,但营养生长期较长,抽薹较晚,莲座叶衰老速率较慢;在干旱处理条件下,rcpld-oe株系表现出比野生型拟南芥更强的干旱耐受能力。(3)在干旱胁迫处理过程中,rcpld-oe株系莲座叶的水分散失速率降低,可能在一定程度上降低了干旱对膜完整性的损伤和光合作用的抑制,但其渗透调节物质含量的变化相对较小。研究发现,在干旱胁迫条件下,rcpld-oe植株莲座叶的水分散失速率和光合作用抑制程度显著降低,从而表现出明显强于野生型的干旱耐受能力,这为后续RcPLD功能的深入研究和更多砂藓抗旱功能基因的挖掘奠定了基础。

大豆磷脂酶D家族基因全基因组鉴定及耐盐性分析

磷脂酶D(Phospholipase D,PLD)及其产物磷脂酸(Phosphatidic Acid,PA)在植物生长发育和胁迫响应的调控中起着重要作用。目前,对大豆PLD基因家族的研究仍不够全面。为进一步寻找与大豆抗逆性相关的潜在候选基因,本研究利用全基因组分析方法对28个GmPLDs的基因结构、蛋白保守结构域、共线性和系统发育关系等进行研究,并采用qRT-PCR方法分析基因在盐胁迫下的表达量。结果表明:大豆PLD家族基因分布在16条染色体上,片段复制在大豆PLD基因家族的扩展中发挥了重要作用。基因表达模式分析显示GmPLDs在不同组织中的表达存在差异,启动子顺式作用元件分析显示GmPLDs具有参与非生物胁迫和激素途径的潜在功能。qRT-PCR分析显示,18个大豆PLDs基因表达受盐胁迫诱导显著上调,可能参与大豆耐盐胁迫。研究结果为解析及克隆大豆耐盐基因提供理论依据,并为挖掘响应非生物逆境胁迫GmPLDs基因提供了基础信息。

竞争性RT-PCR法定量检测糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D基因的表达

目的 :建立一种定量检测糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D(GPI PLD)基因表达水平的竞争性RT PCR方法 ,以研究GPI PLD与白血病等疾病的关系。方法 :首先用PCR定点诱变法构建GPI PLD的竞争性cDNA模板 ,该模板与靶cDNA具有相同的引物结合区 ,但在长度上要比靶cDNA少 2 0个碱基。把该竞争性cD NA模板在体外转录出的竞争性RNA作为RT PCR的内标准 ,与白血病细胞株K5 6 2细胞的总RNA在同一体系内进行逆转录和PCR扩增 ,二者的PCR产物因长度不同可经电泳区分开 ,然后对电泳图像进行光密度扫描 ,根据已知的竞争性RNA模板的量计算出GPI PLDmRNA的量 ,从而得到GPI PLD基因的绝对表达量。结果 :构建和制备了长度为 198bp的GPI PLD竞争性RNA模板 ,该模板与靶模板呈明显的竞争性RT PCR反应 ;测得K5 6 2细胞GPI PLD基因的表达水平为每纳克 (44 0± 2 0 )拷贝。结论 :成功地建立了一种定量检测GPI PLD基因表达水平的竞争性RT PCR方法 ,该方法具有灵敏、准确等优点。

植物磷脂酶D的分子生物学研究进展

综述了植物磷脂酶D(PLD)的基因研究进展及PLD的分类、结构和功能,并对PLD的应用前景进行了展望。

转基因三倍体毛白杨抗盐试验研究

试验设计4～11g·kg^-18个NaCl浓度梯度，对转PLD／AtNHXI基因抗盐碱三倍体毛白杨进行组培苗抗盐分化试验，设计2～10g·kg^-19个NaCl浓度梯度进行组培苗抗盐生根试验，设计3～12g·kg^-110个NaCl浓度梯度对1年生盆栽苗进行抗盐试验，结果表明：在NaCl浓度达8g·kg^-1时，转基因三倍体毛白杨分化培养37d后，组培苗的叶色、分化芽数及新稍长度开始受到影响，随着NaCl浓度的增大将抑制组培苗分化生长，甚至枯萎死亡；在含NaCl7g·kg“的生根培养基中，培养20d后，虽然叶色没有受到盐太大的影响，但生根和新稍的生长都开始受到抑制，根系明显的减少；在含NaCl7g·kg^-1的土壤条件下，盆栽苗培养32d后，开始表现出盐害症状。

甘蓝磷酯酶D HKD2功能区基因片段的克隆与反义表达载体的构建

以甘蓝 (Brassiaca oleracea)为材料 ,取幼叶分离 m RNA,反转录合成 c DNA,以 c DNA第一链为模板 ,通过 PCR扩增 ,获得甘蓝磷酯酶 D (Phosphorate Lipid Dehydrolase,PLD) HKD2功能区的基因片段 .对其进行Blast分析 ,结果表明 ,分离的目的片段核苷酸序列与 Genbank中报道的甘蓝 PLD基因相比同源率为 99.7% ,只有 2个碱基发生改变 .将得到的 PLD基因片段插入植物表达载体 p AT940 ,构建了 PLD基因反义表达载体p ATC-r PLD,为下一步进行抗逆转基因作物选育打下基础 .

硒对糖尿病大鼠肝脏磷脂酶D基因表达的影响

目的:研究硒对糖尿病大鼠代谢相关基因表达的调控作用。方法:对前期研究分离到的与补硒50μg/kgbwd有关的糖尿病大鼠差异显示的基因片段进行克隆、测序及同源性分析,选择目的基因进行RT-PCR验证,以观察各组大鼠之间肝脏中基因表达的变化。结果:差异显示基因片段Se-4的碱基序列与磷脂酶D(PLD)基因片段的同源性为100%。RT-PCR验证结果显示:PLDmRNA在糖尿病对照组、糖尿病补硒组大鼠肝脏中的表达水平较正常对照组明显增高,但糖尿病补硒组PLDmRNA的表达较糖尿病对照组有所降低(P<0.05)。结论:硒可抑制糖尿病大鼠肝脏中PLDmRMA的表达,这可能是硒改善糖尿病糖、脂代谢紊乱的分子机制之一。

补锌糖尿病大鼠肝脏糖脂代谢相关基因表达

目的探讨补锌对糖尿病大鼠肝脏糖脂代谢相关基因蛋白磷酸酶2A(PP2A)和磷脂酶D(PLD)表达的调控。方法对补锌糖尿病大鼠差异显示的基因片段进行克隆、测序及同源性分析;设计基因序列引物,RT-PCR检测观察各组大鼠肝脏中基因表达的变化。结果结果显示,片段Zn-4、Zn-8的碱基序列分别与PLD、PP2A同源性为100%,99%。糖尿病对照组PP2A mRNA表达量(0.5072±0.0574)低于正常对照组(1.3303±0.1855),P<0.05;糖尿病补锌组PP2A mRNA的表达量(0.7005±0.1563)与糖尿病对照组比较有所恢复(P<0.05)。糖尿病对照组PLD mRNA表达量(1.0754±0.0312)和糖尿病补锌组PLD mRNA的表达量(1.0130±0.0992)均高于正常对照组(0.7995±0.1040),P<0.05;糖尿病补锌组PLD mRNA的表达量与糖尿病对照组比较无变化(P>0.05)。结论补锌对糖尿病大鼠肝脏PP2A mRNA表达有上调作用,这可能是锌改善糖尿病糖、脂代谢紊乱的分子机制之一。

日本结缕草(Zoysia japonica)磷脂酶D基因部分保守序列的克隆及其对机械损伤的响应

以日本结缕草Zenith为材料,通过同源克隆的方法克隆出其磷脂酶D(PLD)基因部分保守序列,序列长399 bp,并通过实时荧光定量PCR检测PLD基因在机械损伤胁迫下随时间变化的表达模式。结果表明,磷脂酶D在胁迫2 h内大量表达,随后逐渐降低,在9 h已接近于对照水平,说明PLD基因在损伤初期大量参与了应对机械损伤胁迫的防御与修复过程,在损伤后期其作用减弱或被代替;电导率的测定结果表明,细胞膜结构在胁迫初期遭到极大程度的破坏,胁迫9 h后膜损伤程度开始减轻。结合PLD基因和电导率的表达模式,推测PLD基因在6 h内会激活一系列感受信号及下游信号分子,9 h后其相应防御机制发挥作用来减轻胁迫造成的损害。

茶叶中掺杂大米成分实时荧光PCR检测方法的建立和应用

为探索茶叶中掺杂大米的快速检测方法,根据大米内源PLD基因建立茶叶掺杂大米成分的实时荧光PCR检测方法。通过对样品前处理、方法特异性、方法灵敏度、污染因素的分析,认为该方法用于检测茶叶中掺杂大米成分可以达到理想效果,操作简便,检测结果可靠性高,重复性好,结果判读直观无污染。利用所建立的方法对36份茶叶样品进行分析,发现6批次产品一定程度上掺杂了大米成分。

NAPE-PLD与FAAH基因多态性与中国汉族精神分裂症的相关性研究

目的探讨NAPE-PLD基因rs12540583和FAAH基因rs2295633、rs324420、rs6429600多态性以及两个基因的交互作用与汉族精神分裂症发生的相关性。方法应用PCR-限制性片段长度多态性及DNA测序技术对345例精神分裂症患者和403名正常对照进行基因多态性检测，运用SPSS 17.0对数据进行分析，用多因素降维（multifactor dimensionality reduction，MDR）分析基因之间的交互作用。结果rs12540583基因型和等位基因的分布在两组之间的差异具有统计学意义（χ2＝17.18，P〈0.0125；χ2＝18.94，P〈0.0125），且AC基因型为精神分裂症发病的风险基因型，C等位基因为风险等位基因。MDR分析提示NAPE-PLD和FAAH基因的交互作用与精神分裂症相关，而四因子模型（rs12540583、rs324420、rs2295633以及rs6429600）是其最佳模型。结论NAPE-PLD基因rs12540583位点的AC基因型以及C等位基因为精神分裂症的风险因素。NAPE-PLD与FAAH基因在精神分裂症的发病中存在交互作用，最佳模型为四因子模型。

蛋白三维构象模拟与食管鳞状细胞癌p16基因变异的功能意义评估

目的通过对人类食管鳞状细胞癌（esophagecal squamous cell carcinoma，ESCC）P16蛋白三维空间结构改变与临床病理意义的研究，为ESCC的临床防治提供可靠的指标。方法采用聚合酶链反应-单链构象多态性、DNA序列分析、计算机蛋白三维空间构象分析等技术检测了69例ESCC和36份癌旁正常组织标本的p16基因变异和P16蛋白三维空间结构的改变。结果（1）69例ESCC中p16基因变异33例，其中26例氨基酸残基变异位于P16蛋白功能域（M2组）；7例的氨基酸残基变异位于功能域之外（M1组）。统计分析，M2组的淋巴结转移率、远处转移率明显高于M1组（P〈0．05），M2组中临床Ⅳ期的患者显著多于前Ⅰ-Ⅲ（P〈0．05）。但在患者年龄、性别和浸润深度等方面差异无统计学意义（P〉0．05）。结论P16蛋白的4个锚蛋白重复序列是决定P16蛋白功能的关键结构，发生在4个锚蛋白重复序列内的变异将改变P16蛋白的三维空间构象而影响P16蛋白的抑癌功能，使得ESCC淋巴结和远处转移及临床晚期患者显著增多。本研究结果为筛选高危临床病例提供确实的论证和客观的分子病理学指标。

山羊伪结核棒状杆菌TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立和初步应用

为了快速检测无临床症状的山羊是否感染山羊伪结核棒状杆菌（Corynebacterium pseudotuberculosis）,根据Gen Bank中伪结核棒状杆菌磷脂酶D（phospholipase D,PLD）基因序列,分别设计1对特异性引物和Taq Man探针,经过反应条件和体系优化,测定特异性、敏感性和稳定性,建立山羊伪结核病Taq Man荧光定量PCR检测方法,并对54份临床样品进行检测。结果显示：建立的山羊伪结核棒状杆菌方法具有很好的特异性,在20μL扩增体系中,引物浓度为0.20μmol/m L,探针浓度为0.45μmol/m L,退火温度59℃时最佳;最低可检测出4.6×102个拷贝数的细菌DNA,标准曲线相关系数是0.996。同时,对Taq Man荧光定量PCR和常规PCR进行了比较,前者的敏感性是后者的1 000倍;对54份临床样品进行检测,Taq Man荧光定量PCR检出的阳性率为68.5%（37/54）,常规PCR检出的阳性率为53.7%（29/54）。研究表明：Taq Man荧光定量PCR法检出率较高,有特异、敏感且快速的特点,适用于临床样品的检测。