贵州省安顺地区蛇源裂头蚴分离株的分子鉴定及种系发育关系分析

目的对贵州省安顺地区蛇源裂头蚴分离株进行分子鉴定及种系发育关系的分析。方法采集贵州安顺地区4种常见野生蛇（王锦蛇、乌梢蛇、黑眉锦蛇、灰鼠蛇）来源的裂头蚴,分别提取各裂头蚴基因组DNA,PCR扩增ITS1和cox1基因,所得PCR扩增产物经纯化并T-A克隆后测序。运用ClustalX1.81生物分析软件,将所得序列与GenBank所录迭宫属绦虫和其它属绦虫基因序列进行多重序列比对分析,并应用软件MEGA 6.0构建系统发育树（邻位连接法）。结果成功扩增出8株裂头蚴的ITS1和cox1基因序列,ITS1大小为822～863bp,cox1大小为404～415bp,与预期的基因片段大小一致。基于ITS1和cox1基因序列构建的种系发育树与所有的猬迭宫绦虫均构成同一亚群,总分支的自展值高于50%,二者在不同的分离株之间呈现基因多态性。对8株裂头蚴ITS1和cox1序列的同源性进行比较,ITS1的同源性为70.27%～82.84%,而cox1的同源性为95.63%～99.50%,显示cox1的同源性高于ITS1。已向GenBank提交ITS1和cox1新序列各一条,登录号分别为KF990161和KJ418421。结论贵州安顺地区不同蛇源裂头蚴分离株之间存在基因多态性。从总分支的自展值来看,cox1比ITS1更适合用于种内遗传多态性研究,ITS1适合做定种的分子标记。

猬裂头蚴27kD半胱氨酸蛋白酶基因的克隆、表达及生物信息学分析

目的克隆、表达猬裂头蚴27kDa半胱氨酸蛋白酶(Cysteine protease,CP)基因,并分析其生物学特性。方法提取蛇源猬裂头蚴总RNA,逆转录合成cDNA,PCR扩增27kDa半胱氨酸蛋白酶(27kDa CP)基因,克隆入pMD-19T载体,测序正确后将27kDa-CP基因亚克隆入表达载体pET-28a(+),构建pET-28a(+)-27kDa-CP重组质粒,转入大肠埃希菌Transetta(DE3)中,经IPTG诱导,表达目的蛋白27kDa CP。用镍离子柱亲和层析法纯化目的蛋白。表达产物用SDS-PAGE及Western Blotting进行分析,并运用NCBI和ExPASy等有关的生物信息学分析工具,对27CP基因及其编码蛋白进行预测和分析。结果 CP基因序列的开放阅读框长为1 011bp,去除信号肽序列长954bp,登录到GenBank,获得登录号ANA52569。该基因编码一个含317个氨基酸的蛋白多肽,属于Peptidase_C39_like超家族,理论分子量约35 669.9Da,等电点5.92。pET-28a(+)-27kDa-CP重组质粒经IPTG诱导后,蛋白在大肠埃希菌中成功表达,经纯化后的蛋白利用Western blotting检测,证明与预期大小相符,且与猬裂头蚴感染阳性血清有较好的结合反应。结论成功克隆、表达了猬裂头蚴27kDa CP基因,获知CP基因及其编码的氨基酸序列和生物信息学。

贵州安顺王锦蛇体内猬迭宫绦虫成虫及裂头蚴超微结构

目的:观察贵州安顺王锦蛇体内猬迭宫绦虫成虫和裂头蚴的超微结构。方法:采集安顺地区王锦蛇体内的裂头蚴,进行形态学及分子鉴定;将裂头蚴喂饲感染犬(10条/犬)1月后剖杀,获得成虫,将成虫及裂头蚴标本用戊二醛-锇酸双重固定、乙醇梯度脱水、真空冷冻干燥及喷金后,用S-3400扫描电镜观察其超微结构。结果:(1)裂头蚴经cox1基因片段测序结果与Gen Bank中的猬迭宫绦虫(登录号GQ999947)的基因序列一致性为99.12%;(2)成虫体表微毛覆盖,背、腹面上各有一条纵行的吸槽,其内面的微毛呈丝状型,其余部位呈圆锥状棘状型;成虫头节呈指状、颈部短而粗,成节和孕节腹面有5条纵行的半球形颗粒状丘团,在成节腹面上部中央,从上而下,可见雄性生殖孔、雌性生殖孔及子宫孔,可见阴茎自雄性生殖孔伸出,阴茎呈短圆柱状,生殖孔周围由许多生殖乳突围绕;(3)裂头蚴呈长带状,前后两端略膨大,不分节,但表面有深的不规则的横向皱褶;虫体前端中央有一窄横向凹陷,周围体壁呈唇状突起,后端的结构类似前端,但中央的凹陷及唇状突起较前端扁平;虫体体表密布微毛,微毛的长短不一,前段及后段的微毛为圆锥状的棘状型,中段的微毛有圆锥状、棘状型和镶嵌在圆锥状微毛中矛尖状的棘状型,后者数量较少。结论:通过对贵州安顺王锦蛇体内猬迭宫绦虫成虫和裂头蚴的超微结构观察,有助于王锦蛇体内猬迭宫绦虫的后续研究。