人细胞增殖相关激酶plk3基因逆转录病毒载体的构建及对细胞增殖的影响

目的：构建人细胞增殖相关激酶基因plk3的逆转录病毒载体（RV），观察该基因对细胞增殖和细胞周期的影响。方法：将plk3基因亚克隆至pMSCV-puroR载体中，经酶切和测序鉴定，制备高滴度的RV，以流动感染法高效感染，半固体集落培养法测定基因导入率：用嘌呤霉素筛选后，获得K562-plk3-puroR和HL60-plk3-puroR细胞。以野生型细胞和导入空载体的K562-puroR和HL60-puroR细胞作为对照，用PCR鉴定基因的导入，并测定细胞周期及凋亡率等，研究plk3基因导入对细胞的影响：结果：获得pMSCV—plk3-puroR质粒并经酶切和测序证实。对K562和HL60细胞的基因导入率，分别达82．3％±3．70%和62．9％±4．94％（n=3）。经嘌呤霉素筛选后，转基因细胞的阳性率〉99％。K562-plk3-puroR和HL-60-plk3-puroR转基因细胞的增殖曲线比对照细胞降低（P〈0．01）；而导入空载体的K562-puroR和HL60-puroR细胞的增殖曲线与野生型细胞相比较无显著差异．与K562细胞相比较，常规培养时，处于G0～G1期的K562-plk3-puroR细胞增多[（49．7±3．38）％vs（43．9±2．34）％，P=0．03]．以无血清培养堆培养10h后，进入S期的K562-plk3-puroR细胞减少[（43．6±3．74）％vs（54．5±1．52）％，P=0．02]，凋亡率降低[（1．3±0．31）％vs（3．4±0．37）％，P=0．01]，结论：构建了plk3基因的逆转录病毒载体，发现plk3基因的导入叮延缓细胞增殖，并抑制细胞进入增殖周期.