低背景、高分辨率PAGE简易银染法

聚丙烯酰胺凝胶电泳银染一直存在耗时长、步骤繁琐等缺陷,是其批量应用的瓶颈。文章报道了一种低背景、高分辨率的PAGE简易银染方法,该法在降低NaOH浓度和批量显带方面进行了有益的探索,建立了节省时间、节约试材,对批量显带尤为实用的简易银染法。

Research on Sex and Tissue Differences in Isozymic Phenotype of Varicorhinus macrolepis through Isozyme Electrophoresis

Polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and biochemical staining method were used in this study for the analysis on malate dehydrogenase (MDH,E.C. 1.1.1.37) isozymes zymogram in 11 different types of tissues of male and female Varicorhinus macrolepis. It had been found for the first time that the phenotype of malate dehydrogenase (MDH),acid phosphatase (ACP) and superoxide dismutase (SOD) showed difference between male and female V. macrolepis,and there was no difference among different individuals in the same sex. Therefore,the electrophoresis band of malate dehydrogenase,acid phosphatase and superoxide dismutase could be used as an indicator for the identification of gender and tissues of V. macrolepis,which would provide basic data for the developmental genetics,variety improvement and directed breeding of V. macrolepis groups,thus facilitating the development and protection of this valuable fish species.

PAGE银染和条带回收方法的改进

为了提高聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）的银染效果和条带回收的效率,以广玉兰DNA为材料进行ISSR-PCR分析,比较了两种银染（常规银染法和快速银染法）和条带回收法（乙醇糖原法和改进的煮沸法）.结果显示：两种银染方法效果一致,但常规银染要用2-3 h,而快速银染仅用30 m in,是常规银染的1/6-1/4;改良的煮沸法回收条带比乙醇糖原法更简便、更快捷.因此,快速银染和改良的煮沸法条带回收法可以应用在以后的研究中.

用变性PAGE-银染法鉴定小麦抗条锈基因Yr5的RAPD标记

以小麦抗条锈病基因Yr5的供体亲本Triticumspeltaalbum作为对照 ,对近等基因系Yr5 6×AvocetS和感病亲本AvocetS进行RAPD分析。扩增产物用 4%变性PAGE分离 ,银染显色。在变性PAGE上可以检测到 50～ 10 0条带 ,是琼脂糖凝胶电泳的 5倍以上。筛选了 2 40个随机引物 ,发现 2 3条稳定的多态性DNA片段 ,初步检测表明其中6条与Yr5基因具有连锁性。用 12 1株AvocetS和Yr5 6×AvocetS杂交制备的F2 代分离群体进一步进行的遗传连锁性检测表明 ,多态性DNA片段S13 2 0 2 0 7和S13 4 83 6 3 分别与Yr5基因完全连锁和紧密连锁。结果表明 ,用变性PAGE分离PCR产物并结合银染显色 ,提高了小麦RAPD分析的多态性水平 。

SDS-PAGE-薄层扫描联用法测定3种不同来源的乳铁蛋白

目的:建立快速、简便测定鲜牛奶、转基因牛奶和人乳中乳铁蛋白的方法。方法:在对样品脱脂和去除酪蛋白时,水洗乳脂、酪蛋白以提高乳铁蛋白的回收率。通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodiumdodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分离乳清蛋白,薄层扫描法定量。对电泳和薄层扫描的条件进行优化,电泳使用1.0mm×10齿的试样格、分离胶质量浓度12g/mL、分离电压100V、上样量5μL、染色3h、脱色2h;薄层扫描采取锯齿、双波长、透射的扫描方式,Y步长和摆幅宽分别为0.1mm和8mm。结果:可以分离不同来源乳中的乳铁蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白;乳铁蛋白加标回收率分别为104.53%、108.37%,同板精密度RSD值为3.1003%和1.8151%,在100～2000μg/mL范围内呈线性关系,相关系数为0.9988和0.9990。结论:此方法可以用于3种乳中乳铁蛋白的测定。

SDS-PAGE凝胶电泳法对不同种鹿茸蛋白质差异化研究

目的:利用电泳方法研究市场上药典规定品种的鹿茸饮片及其混淆品中蛋白质的差异,为鹿茸的免疫鉴定技术研究提供研究依据。方法:采用蛋白溶解液法提取各鹿茸蛋白,以牛血清蛋白为对照,利用Bradford法测定鹿茸水溶性蛋白的浓度,利用SDS-PAGE凝胶电泳法分析花鹿茸、马鹿、新西兰赤鹿及驯鹿的蛋白差异。结果:用7.5%分离胶系统分离花鹿茸、新西兰马鹿、马鹿及驯鹿的水溶性蛋白,四者蛋白条带有差异。结论:利用SDSPAGE凝胶电泳法考察不同品种鹿茸的蛋白差异,为不同品种鹿茸的定性研究提供依据和研究基础。

不同浓度和梯度的SDS-PAGE胶对双向电泳中蛋白分离的影响

目的:探讨双向电泳中不同浓度和梯度的SDS-PAGE胶对肠道菌蛋白分离效果的影响。方法:制备弗氏2a志贺菌2457T野生株37℃晚期全菌蛋白质样品,进行不同浓度及梯度的SDS-PAGE,研究分离肠道菌蛋白最适宜的SDS-PAGE胶浓度。结果:获得了3个不同浓度(10%、12.5%和15%)的均一胶电泳图谱和3个不同梯度(4%～15%、10%～20%和12%～14%)的电泳图谱,并比较了这些图谱的分离效果;同时,为了分析肠道菌天然表达蛋白的相对分子质量范围,鉴定了8个极端相对分子质量蛋白。结论:对于肠道菌蛋白质的分离来说,12.5%的均一胶或12%～14%的梯度胶较为适宜。

旋毛虫与伪旋毛虫肌幼虫抗原的SDS-PAGE和双向电泳分析

目的鉴定旋毛虫(Trichinella spiralis,T1)与伪旋毛虫(T.pseudospiralis,T4)肌幼虫的差异蛋白。方法应用SDS-PAGE和双向电泳(two-dimensional gel electrophoresis,2-DE)对T1、T4肌幼虫的可溶性抗原与培养24h的ES抗原的蛋白组分进行分析。结果SDS-PAGE显示,T1肌幼虫可溶性抗原有22条蛋白带(221.62kDa～14.88kDa),其中6条为T1特异性蛋白带(59.72、44.37、23.66、22.36、18.26、16.34kDa);T4可溶性抗原蛋白有18条带(185.28kDa～14.27kDa),其中4条为T4特异性蛋白带(132.60、119.30、35.26、31.02kDa)。T1的ES抗原有10条蛋白带(113.21kDa～14.37kDa),T4的ES抗原有9条蛋白带(104.71kDa～14.51kDa),T1、T4肌幼虫ES抗原的蛋白带均不相同。2-DE显示,T1可溶性抗原有193±12个蛋白点,分子量主要为11kDa～22kDa、25kDa～64kDa及100kDa～144kDa,所对应的等电点(pI)分别为4.7～8.2、4.5～6.5及5～7;T4可溶性抗原有175±9个蛋白点,分子量主要为12kDa～21kDa及25kDa～90kDa,所对应的pI分别为4～9.5与4.5～9.6。T1的ES抗原具有82±6个蛋白点,分子量主要为13kDa～16kDa、18kDa～22kDa及40kDa～55kDa,所对应的pI分别为4～7、3.8～6.2及5～9;T4的ES抗原具有69±5个蛋白点,分子量主要为10kDa～15kDa、17kDa～25kDa及29kDa～55kDa,所对应的pI分别为4.7～6.5、4.6～6及5～7。结论旋毛虫肌幼虫可溶性抗原及ES抗原的蛋白组分与伪旋毛虫的明显不同。

植物乳杆菌在不同盐质量浓度下生长至对数期中期全蛋白SDS-PAGE分析

以耐盐植物乳杆菌FS5-5为研究对象,采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术构建了菌株在Na Cl质量浓度分别为0、3、6、9 g/100 m L的培养基中生长至对数期中期的全蛋白表达图谱。通过比较分析,选取了6个差异蛋白质条带,并采用液相色谱-质谱/质谱联用对差异蛋白质条带进行质谱分析。结果表明:1号样品条带鉴定得到6种蛋白;2号样品条带鉴定得到11种蛋白;3号样品条带鉴定得到9种蛋白;4号样品条带鉴定得到4种蛋白;5号样品条带鉴定得到15种蛋白;6号样品条带鉴定得到15种蛋白。去除相同的蛋白,共有45种蛋白得到鉴定。这些蛋白大致可以分为4类:与蛋白质合成有关的蛋白25种;与代谢相关的蛋白10种;与核苷酸合成有关的蛋白8种;未知功能蛋白2种。可能由于这些蛋白的表达发生变化,才导致菌体中蛋白质合成、能量代谢、DNA复制能够正常进行,最终使植物乳杆菌FS5-5能够更好地在盐环境下生存下去。

鳖甲炮制前后抗肝纤维化活性部位的SDS-PAGE凝胶电泳比较研究

目的:探讨鳖甲炮制前后抗肝纤维化活性部位的差异,为鳖甲药材的临床用药提供依据。方法:运用SDS-PAGE技术,对生鳖甲与醋鳖甲活性部位进行分析比较;采用MTT比色法测定生鳖甲与醋鳖甲对HSC-T6增殖的影响。结果:炮制后的醋鳖甲所含成分增多,一级谱带相对分子质量降低,导致小分子肽类物质产生;生鳖甲和醋鳖甲均具有抗肝纤维化的作用,但醋鳖甲的药效优于生鳖甲。结论:鳖甲炮制前后活性部位明显差异,为临床选择用药及进一步活性成分研究提供依据。

一种新的微卫星PAGE的DNA显带方法

提出了一种新的微卫星聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)显带方法,即微卫星PAGE荧光染料显带法,与琼脂糖凝胶荧光染料显带法和PAGE银染显带法相比,该法具有简单易行、快速高效、分辨率高、背景清晰等特点,是一种成功的DNA显带技术。

脱脂松仁粕中球蛋白的提取工艺及其SDS–PAGE分析

以脱脂松仁粕为原料,采用Osborne法提取松仁粕中的球蛋白,设NaCl质量分数(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%)、料(质量,g)液(体积,m L)比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35)、提取时间(30、60、90、120、150、180 min)和提取温度(40、45、50、55、60、65℃)4个单因素试验,再用响应面法优化松仁粕中球蛋白的提取工艺,并对其分子量进行分析。结果表明:当NaCl质量分数为2.5%,料液比为1∶15,提取时间为150 min,提取温度为56℃时,松仁粕中球蛋白的提取率较高,为15.32%;SDS–PAGE分析结果表明,脱脂松仁粕球蛋白的分子量为41 320、27 520、21 690、16 310、15 180。

中国与日本不同地域品系日本血吸虫蛋白组分的SDS-PAGE和EITB分析

目的： 补充观察我国浙江、江西、台湾省和日本山梨的日本血吸虫成虫的蛋白组分， 以及上述４ 地和安徽、湖北、四川、云南省血吸虫与广西省钉螺和日本钉螺抗血清的反应性。方法： 采用ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳 （ＳＤＳ－ＰＡＧＥ） 和酶联免疫电转移印迹 （ＥＩＴＢ） 分析。结果与结论： 浙江、江西、台湾省和日本的血吸虫隔离群雄虫及雌虫抗原经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ后， 以考马斯亮蓝染色结果分别可见７～１７ 条（江西省和日本的血吸虫雄虫条带显色很淡） 及１～６ 条显色带；银染结果分别可见１４～２３条及４～１９ 条（台湾省的血吸虫雌虫仅见１条极淡的）显色带。台湾省血吸虫雄虫与浙江省血吸虫雄虫谱型相似， 但在８１ ｋＤａ以上组分有所不同， 江西省血吸虫雄虫５４ｋＤａ 条带明显， 日本的血吸虫雄虫不仅条带少， 谱型也与浙江、江西及台湾省的血吸虫各异。ＥＩＴＢ结果： 所试血吸虫成虫与广西省钉螺和日本的钉螺抗血清均产生反应， 证明存在交叉反应抗原组分。所试血吸虫成虫与广西省钉螺和日本的钉螺间存在共同抗原组分。

染石英及石棉尘大鼠肺灌洗液SDS-PAGE测定

目的探讨尘肺发病机理。方法采用ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）技术对染石英（２５ｍｇ／只）或石棉尘（５ｍｇ／只）大鼠支气管肺泡灌洗液（ＢＡＬＦ）进行了测定，并在光镜下观察天狼星红染色肺组织Ⅰ、Ⅲ型胶原分布情况。结果染石英不同时间大鼠ＢＡＬＦ中存在５条分子量分别为９０，６６，６０，２５，１４ＫＤ的蛋白质条带。染石棉大鼠ＢＡＬＦ仅有一条带，分子量为６６ＫＤ。染石英两周时，大鼠肺组织细胞纤维性结节中即有少量Ⅰ型胶原沉积，２个月时Ⅰ型胶原明显增加、粗大。石棉组３个月时肺间质中有Ⅰ型胶原存在。两组均未见明显Ⅲ型胶原。

SDS-PAGE凝胶电泳对驴皮胶及常见伪品胶中的蛋白分析研究

目的:研究驴皮胶及常见伪品胶马皮胶和牛皮胶的蛋白凝胶电泳行为。方法:自制3种皮胶,计算出胶率,BCA蛋白浓度测定试剂盒测定其蛋白含量,计算上样量,使上样量为20~30μg。垂直电泳仪进行SDS-PAGE凝胶电泳,采用考马斯亮蓝及银染法显色。结果:3种皮胶的凝胶电泳行为相似,蛋白成分主要集中在分子量大于25 kDa段上,银染法灵敏度更高,可显示较多条带。结论:3种皮胶分子量分布宽泛,具有共同的条带,进一步可用多肽蛋白质谱鉴定技术对各混合物组分进行更深入分析。

几种SDS-PAGE凝胶电泳染色方法的比较

[目的]对几种SDS-PAGE凝胶电泳染色方法进行比较。[方法]从凝胶背景颜色、染色时间及灵敏度的角度对6种SDS-PAGE凝胶电泳快速染脱色方法进行比较研究,并对适用于椰子和油棕总蛋白质SDS-PAGE凝胶电泳的实用方法进行总结。[结果]方法 F最快速,条带清晰,染料及试剂都较少,是一种经济、快速、安全、实用的染色方法,整个过程仅需1 h左右。[结论]试验比较了几种SDSPAGE凝胶电泳染色方法,对进一步开展椰子和油棕蛋白质组学研究具有重要意义。

SDS-PAGE法检测动物肌肉蛋白质加热终点温度的研究

为了探索检测动物组织蛋白质热变性程度的方法,分别对猪、牛、羊、鸡、鱼五种新鲜动物肌肉组织进行不同温度的热处理(新鲜未加热、50、60、70、80、90、100℃),对处理后的样品提取蛋白质进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。结果显示,同种动物组织经不同温度热处理,所得电泳图谱具有较大差异,电泳条带的数量随温度的升高逐渐减少,猪、牛、羊三种动物肌肉组织加热到80℃后,电泳图谱不再变化,达到加热终点温度;鸡和鱼的肌肉组织加热到70℃后,电泳图谱不再变化,达到加热终点温度。不同种动物组织经相同温度热处理所得电泳图谱显示:猪、牛、羊三种动物组织蛋白质的电泳图谱相似,与鸡和鱼组织蛋白质的电泳图谱差异显著。

利用往返电泳法(R-PAGE)检测马铃薯纺锤块茎类病毒技术要点

目前国内普遍采用的往返电泳法是检测马铃薯类病毒的主要方法之一,但该方法存在灵敏度低,重复性差等问题。因此,针对上述问题总结出一些技术要点:(1)保证植物生长环境及正确取样;(2)提高凝胶中RNA的浓度和质量;(3)控制好反向电泳的温度和时间;(4)及时更换染色液。

五株钩体外膜蛋白和脂多糖的SDS-PAGE、2D-PAGE图谱的比较研究

作者采用SDS-PAGE、2D-PAGE结合银染色法及免疫印迹技术对五株不同致病力钩体外膜蛋白和脂多糖作比较研兜。SDS-PAGE分析发现三株致病钩体外胰蛋白电泳图谱非常相似,与两株非致病性钩体电泳图谱无相关关系。强毒力017株外膜21.5kd区带的蛋白含量明显高于两株弱毒力钩体。2D-PAGE图谱差异更大,主要表现为pI的分布不同。用抗017株的McAb(LB_1)对五株外膜进行免疫印迹分析。该McAb主要识别三株致病性钩体共有的41kd抗原。三株致病性钩体外膜脂多糖电泳图谱与两株非致病钧体外膜脂多糖电泳图谱迥然不同。

SDS-PAGE法测定蒜酶相对分子质量及含量

目的采用还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)法测定蒜酶的相对分子质量及含量。方法建立测定蒜酶的凝胶电泳条件:分离胶12%,浓缩胶5%,初始电压80V,进入分离胶时电压调至100V,测定经提取纯化后的蒜酶和大蒜样品中蒜酶的分子质量及含量。结果通过SDS-PAGE法确定以磷酸盐缓冲液为溶剂,蒜酶供试品浓度27.2 mg/mL进行蒜酶含量和相对分子质量测定;蒜酶供试品中蒜酶平均相对分子质量50.84KDa,蒜酶供试品中蒜酶在总蛋白条带中平均相对含量为52.39%,大蒜中蒜酶在总蛋白条带中平均相对含量为6.28%。结论 SDS-PAGE法测定蒜酶含量及其相对分子质量,方法简便易行、结果准确可靠。