马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种real-time PCR检测方法的建立与应用

本研究建立了一种特异性实时聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)检测方法,根据模式菌株马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种ZW3的16S rDNA序列和全基因组序列设计筛选特异性引物,采用SYBR Green I荧光染料建立real-time PCR方法,并对方法的特异性、灵敏度、重复性和混合体系等进行检测。结果表明,本研究所建立的方法特异性强、灵敏度高、重复性好,建立real-time PCR的标准曲线,其决定系数R2为0.965,具有良好的线性关系,且在马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种及混合体系中可以特异性检出。综上,本研究建立的real-time PCR法可以快速、准确地检测马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种,为马乳酒样乳杆菌的特异性定性定量检测提供了一种新的方法。

序列特异引物引导的聚合酶链式反应(PCR-SSP)结合血清学在疑难血型鉴定中的应用

目的 探讨血型血清学与序列特异引物引导的聚合酶链式反应(PCR-SSP)基因分型在ABO疑难血型鉴定中的作用。方法 用血清学分析鉴定的ABO疑难血型标本80例,同时采用PCR-SSP法进行基因分型,结合两种方法学结果,确定血型及制定输血策略。结果 血清学鉴定亚型40例,其他原因引起的抗原抗体缺失或减弱正常血型40例;PCR-SSP法基因分型亚型41例(3例二者结果不一致:血清学Ael型1例,基因分型O2O2;血清学O型1例,基因分型BO1;血清学A型1例,基因分型AB),正常血型39例。结论 使用血清学结合基因分型鉴定ABO疑难血型具有重要意义。

广西道地药材肉桂及阴香的DNA分子鉴定研究

建立一种能够准确鉴别肉桂及阴香的特异性聚合酶链式反应方法,以保障肉桂用药的安全性和有效性。通过对比分析肉桂及阴香的psbA-trnH序列差异找到特异性单核苷酸多态性位点,设计特异性引物,通过优化退火温度、循环次数,评估不同聚合酶种类和不同基因扩增仪等扩增条件对不同来源的肉桂及阴香进行特异性扩增,根据特异性扩增条带进行鉴别。结果表明退火温度为54℃,循环次数为35次时,肉桂经肉桂特异性引物扩增后在100~200 bp处出现特异性条带,阴香无条带;退火温度为56℃,循环次数为40次时,阴香经阴香引物扩增后在200~300 bp处出现特异性条带,肉桂无条带。该研究所建立的特异性PCR方法可以快速准确鉴别出肉桂及阴香,为控制肉桂的质量安全提供参考。

中国北方汉族人群HLA-A、HLA-B、HLA-DR等位基因频率检测及其临床意义

目的从基因水平了解中国北方地区汉族人群人类白细胞抗原HLA-A、HLA-B、HLA-DR位点的 等位基因(以下分别简称为A等位基因、B等位基因及DR等位基因)频率,获得更完整、准确的HLA群体遗传学 数据。方法 应用聚合酶链反应一序列特异性引物(PCR-SSP)方法对2000名北方汉族健康志愿者进行A、B、DR 等位基因分型。结果鉴定了17个A等位基因,32个B等位基因,13个DRB1等位基因。最常见的基因型分别 为A*02、B*13、DRB1*15,其相应基因频率范围分别为0.2400-0.2767、0.1330-0.1432和0.1557-0.1707。结 论 本结果可作为我国HLA多态性研究的群体资料和正常参考值,对群体遗传、疾病关联研究以及寻找HLA 相合的异基因造血干细胞供者具有重要意义。

PCR-SSP技术对广东汉族人HLA-DR基因分型

探索具有高分辨率、高特异性和简捷快速的方法对ＨＬＡ－ＤＲ基因分型，为临床器官移植配型和疾病相关性分析提供实用的方法和基础资料．利用ＤＲ１～ＤＲｗ１８序列特异性的１９组引物及１对内参照引物进行ＰＣＲ扩增即ＰＣＲ－ＳＳＰ对ＨＬＡ－ＤＲ进行基因分型，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色，在紫外光下观察分型结果．每个被检个体的ＤＲ型别可由特异引物扩增出现的电泳谱带直接判断．双盲检测２２例的结果１００％正确．在１０２例中国广东地区汉族人中，ＤＲ９和ＤＲ２的基因频率最高，分别为０．２２０５和０．１９１２，ＤＲ１０为最低（０．００９８）．与用ＰＣＲ－ＳＳＯ方法分型获得的结果比较，基因型别分布基本一致，但一些等位基因的频率有差异，表明ＨＬＡ－ＤＲ基因频率的分布在不同地区、不同种族的人群间存在着差异．ＰＣＲ－ＳＳＰ法分辨率和特异性虽不及ＰＣＲ－ＳＳＯ法但比血清学方法精细，分型的全过程只需２～４ｈ能满足临床器官移植配型的要求．基因频率调查结果为器官移植配型和疾病相关性分析提供了基础资料．

HLA-DRB1、DQB1基因多态性与流行性出血热的相关性

目的从基因水平探讨HLA-DRB1、DQB1等位基因多态性与流行性出血热的相关性,以阐述其免疫遗传学特征。方法应用序列特异性引物聚合酶链反应技术检测流行性出血热患者和正常对照组各50例的HLA-DRB1、DQB1等位基因。结果流行性出血热患者与正常对照组比较,HLA-DRB1*16等位基因分布频率明显增高(Pc=0.010 6),两组间其余HLA-DRB1-、DQB1等位基因分布频率差异无统计学意义(Pc>0.05)。结论HLA-DRB1*16等位基因与流行性出血热呈正相关,可能为流行性出血热易感基因之一。

PCR-SSP法检测胎儿、新生儿ABO血型

目的 研究用PCR SSP法鉴定胎儿、新生儿血型及基因型。方法 用PCR SSP法检测 5 6例 16周以上孕妇的胎儿、新生儿脐血红细胞基因型 ;用常规法检测双亲及胎儿、新生儿血红细胞ABO血型。结果 用PCR SSP法检测出全部 5 6例脐血ABO血型及基因型 ;PCR SSP法检测出的子代血型与由父母血型按孟德尔遗传规律推测的子代血型符合率达 10 0 % ;用常规法检测脐血ABO血型 ,检出率为 87.5 %。结论 PCR SSP法检测子代ABO血型方法可靠 。

肾综合征出血热与HLA-DR基因多态性的关联

目的 探讨人类主要组织相容性复合体 -DR(HLA DR)基因多态性与肾综合征出血热 (HFRS)之间的关联性。方法 采用聚合酶链反应 -序列特异性引物 (PCR SSP)DNA分型技术对遵义地区汉族 3 9例HFRS患者和2 8例健康对照进行HLA DR基因分型。结果 HLA DRB3 基因频率在HFRS患者组较正常对照组明显增高 (RR =5 .0 4,χ2 =9 988,P <0 0 1) ;HLA DRB1 0 90 12基因频率较正常对照组明显降低 (RR =0 2 4,χ2 =7 2 16,P <0 0 1) ;其它等位基因频率在患者组与对照组间无显著性差异。结论 在遵义地区汉族人群中 ,肾综合征出血热可能与HLA DRB3 基因呈正相关 ,与HLA DRB1 0 90

二球悬铃木花粉变应原特应性体质与HLA-DRB1等位基因相关性分析

目的建立对二球悬铃木花粉过敏的特应性体质者的HLA-DRB1等位基因的PCR-SSP检测方法,探讨江苏汉族人二球悬铃木花粉变应原特应性体质者与HLA-DRB1等位基因的相关性。方法用酚-氯仿法提取全血DNA,合成8对等位基因特异性引物,用PCR-SSP方法检测20例江苏汉族二球悬铃木花粉过敏体质者和36例健康人HLA-DRB1*0401,*0402,*0403,*0404,*0405,*0406,*0407,*0408等位基因。结果经优化实验条件,建立了HLA-DRB1的8个等位基因的PCR-SSP检测方法,获得了患者组和健康人组上述HLA-DRB1等位基因的分布资料。二球悬铃木花粉变应原特应性体质者DRB1*0405和*0406基因频率高于健康人对照组而DRB1*0402基因频率低于健康人对照组。其他5个等位基因频率二组间无显著性差异。结论HLA-DRB1*0406和*0405可能是对二球悬铃木花粉变应原过敏的I型变态反应特应性体质者的可疑候选易患等位基因,而DRB1*0402基因可能是与之相关的具有抵抗作用的等位基因。

Graves病与HLA-DQA1*0301等位基因的相关性研究

为探讨 Graves病 (GD)与人类白细胞抗原 (HL A)等位基因 DQA1 * 0 30 1的相关性 ,以及该等位基因在GD患者中的分布特点。对 90例 GD患者和 6 0例健康对照者 ,采用多聚酶链式反应序列特异引物分析 (PCR-SSP)技术 ,扩增 HL A等位基因 DQA1 * 0 30 1目的 DNA片段 (199bp) ,并观察 DQA1 * 0 30 1等位基因的表达频率 ;采用 EL ISA技术和间接免疫荧光法检测其血清甲状腺激素、甲状腺球蛋白抗体 (TGAb)及抗过氧化物酶抗体(TPOAb)。结果显示 ,GD患者 DQA1 * 0 30 1等位基因频率显著高于对照组 (P<0 .0 1,OR=2 .79) ,但仅在女性患者中差别有显著性 (P<0 .0 0 1,OR=2 .93) ;与是否合并突眼无相关性。提示 HL A- DQA1 * 0 30 1等位基因是中国女性 GD患者的易感基因之一 ,GD和桥本甲状腺炎有一定的共同遗传易感基础。

HLA-DRB1基因多态性与慢性乙型肝炎病毒感染的相关性研究

目的研究HLA-DRB1等位基因与HBV感染慢性化的相关性。方法用PCR-SSP方法对陕西地区汉族慢性乙肝患者108例与正常对照108人以及慢性乙型肝炎表面抗原携带者32人进行HLA-DRB1等位基因分型比较,并进行HLA-DRB1等位基因分型与HBV复制状态相关性分析。结果陕西地区汉族人HLA-DRB1等位基因以DRB1*04(16.2%),DRB1*09(12.5%),DRB1*12(11.6%),DRB1*15(13.4%)最为常见;病例组HLA-DRB1*03的等位基因频率(10.6%)明显高于健康对照组(3.7%),(OR=3.10;P<0.05);HLA-DRB1*07等位基因频率病例组(17.6%)明显高于健康对照组(9.3%),(OR=2.09;P<0.05);DRB1*07基因位点在HBV高复制状态多见(OR=2.22;P<0.05)。结论HLA-DRB1*03、HLA-DRB1*07与陕西地区汉族人HBV感染后的慢性化相关联。该研究提示HLA-Ⅱ类基因与HBV感染慢性化有关联。

皖籍汉族人寻常型银屑病与HLA-Cw*0602等位基因的关联研究

为探讨皖籍汉族人寻常型银屑病(PV)与HLA-Cw0602等位基因的关联性,运用聚合酶链反应-序列特异性引物(PCR-SSP)法,检测了安徽籍汉族人166例PV患者HLA-Cw0602等位基因频率,分析了携带该等位基因的PV患者与其家族史的相互关系,并与248例健康对照相比较。结果:病例组HLA-Cw0602等位基因频率较对照组显著升高(17.9%vs5.4%,OR=4.13,95%可信限2.38～7.16,P<0.001),且无性别差异;携带HLA-Cw0602等位基因的PV患者发病年龄早于不具有该等位基因的PV患者;有PV家族史患者携带HLA-Cw0602等位基因的频率显著高于无PV家族史患者(37.4%vs11.5%,OR=5.62,95%可信限2.54～12.57,P<0.001)。表明皖籍汉族人PV与HLA-Cw0602等位基因高度关联,且携带该等位基因的PV患者易发生早发型(发病年龄<40岁)银屑病,并有家族倾向性。

扩张型心肌病与MHC-DQ基因多态性的关联分析

目的 探讨扩张型心肌病 ( DCM)易感的分子机制和确立一种较为实用的 MHC- 类基因的检测方法。方法 采用聚合酶链式反应和顺序特异性引物 ( PCR- SSP)基因分析方法 ,对 31例扩张型心肌病患者及 30例无血缘关系的健康人的人类主要组织相容性复合体 ( MHC- 类 ) DQ各等位基因及亚基因进行了检测分析 ,并将该方法与其它检测 MHC- 类基因的方法进行对比。结果 结果表明 ,MHC- DQB1* 0 30 1基因与 DCM呈正相关 ( P <0 .0 1) ,其它 MHC- DQB1*其它各等位基因未见异常。结论 MHC- DQB1* 0 30 1基因可能为北方汉族人 DCM的致病易感基因。尽管目前 MHC- 类基因分型方法已有多种 ,但所采用的方法 ( PCR- SSP)具有快速、简便、敏感、准确和可靠等优点。

PCR-RSSO基础上HLA-Ⅰ、Ⅱ基因分型的研究

目的：通过对PCR－DNA技术的分析，探讨人类白细胞抗原（HLA）基因分型方法。方法：采用PCR反向序列特异性寡核苷酸（polymerase chain reaction-reverse sequence specific oligonucleotide,PCR-RSSO)杂交技术，建立改良半量扩增体系全自动HLA－I、Ⅱ等位基因分型方法，进行了635份血液标本HLA－A、B、C、DR、DQ等位基因分型，其中166份DNA同时采用序列特异性引物技术（PCR－SSP）和手工全量扩增体系PCR－RSSO技术。对全自动半量PCR－RSSO、PCR－SSP、手工PCR－RSSO 3种方法做两两比较。结果；全自动半量PCR－RSSO的分型成功率为98．4％（3124／3175），PCR－SSP为98．8％（656／664），手工PCR－RSSO为88．3％（733／830）。经χ^2检验，全自动半量PCR－RSSO与PCR－SSP的分型成功率无统计学差异，与手工PCR－RSSO有显著差异（P＜0．05）。结论：PCR－RSSO可识别HLA－I、Ⅱ共706个等位基因，覆盖WHO命名委员会2000年公布的36个等位基因的75．43％；对706个HLA等位基因的分型均为中－高分辨率，有分辨纯合子等位基因的能力；易长期保存书面的实验原始资料，即杂交条；具有成本低、劳动强度低、省时和DNA消耗量少等优点。PCR－RSSO适合于造血干细胞移植和建立造血干细胞及脐带血干细胞库的组织配型。

湖北食管癌HLA-DQB1的基因多态性

目的从基因水平探讨湖北地区汉族人食管癌 HEN-DQB1等位基因的遗传易感性.方法运用序列特异性引物聚合酶链反应技术,检测无亲缘关系湖北汉族健康人136例、食管癌组42例患者的 HLA-DQB1等位基因.SAS system 统计软件数据处理.结果湖北汉族人食管癌患者与正常人比较,HEN-DQB1*0301基因频率显著增高(0.2976 vs 0.1875),P=0.046,OR=1.835,病因分数=0.1354);两组间 HLA-DQB1其余各等位基因分布频率的比较,HLA-DQB1*0201(0.0833 vs 0.1016),*0301(0.2976 vs 0.1875),*0302(0.0595 vs 0859),*0303(0.2381 vs 0.1875),*0304(0.0000 vs 0.0039),*0401(0.0714 vs 0.0469),*0402(0.0119 vs 0.0156),*0501(0.0357 vs 0.0703),*0502(0.0595 vs 0.0664),*0503(0.0119 vs 0.0195),*0504(0.0000 vs 0.0039),*0601(0.0595 vs 0.0781),*0602(0.0476 vs 0.0742),*0603(0.0000 vs 0.0078),*0604(0.0238 vs 0.0508),差异均无显著性.结论 HLA-DQB1*0301等位基因与湖北汉族人食管癌正关联,为其易感基因.

51例安徽汉族免疫性不育症患者与HLA-DQA1基因相关性及免不Ⅲ号的治疗

目的探讨抗精子抗体阳性的免疫性不育症患者与人类白细胞抗原-DQA1(human leucocyte anti-gen-DQA1,HLA-DQA1)基因的相关性及中医药治疗与HLA-DQA1基因型的关系。方法 采用聚合酶链反应-序列特异性引物(polymerase chain reaction-sequence specific primer,PCR-SSP)技术,对51例抗精子抗体阳性的免疫性不育症患者和60名正常健康人的HLA-DQA1基因进行分型研究,并对患者用中医免疫方免不Ⅲ号(生地、白芍、山萸肉、山药、枸杞子、丹皮、麦冬)治疗3个月。结果 免疫性不育症组HLA-DQA1*0401等位基因频率明显高于正常对照组(χ2=29.869,P<0.01),免不Ⅲ治疗后,27例HLA-DQA1*0401转阴22例(81.5%),差异有统计学意义(χ2=5.24,P=0.022)。结论 HLA-DQA1*0401等位基因可能是抗精子抗体阳性的免疫性不育症的易感基因,HLA-DQA1*0401等位基因的患者经中药治疗有效。

山东地区慢乙肝的预后与HLA-DRB1等位基因相关性研究

探讨山东地区慢乙肝的各种预后与HLA-DRB1等位基因之间的相关性。采用聚合酶链反应/序列特异性引物技术进行HLA-DRB1等位基因的检测,结果发现在慢乙肝组中,HLA-DRB1*0701/*1001出现的频率明显高于正常对照;其乙肝肝硬化组,后者出现的频率与正常对照比较具有统计学上的意义。在乙肝病毒携带组,HLA-DRB1*0701出现的频率明显高于正常对照。

皖籍汉人HLA-DQA1、-DQB1基因型与银屑病的相关性研究

目的探讨HLA－DQA1*0103、－DQA1*0201、－DQB1*0201、-DQB1*0303四种等位基因与皖籍汉族银屑病患者的相关性。方法利用聚合酶链反应一序列特异性引物（PCR-SSP）法，对84名银屑病患者及40名健康对照进行PCR反应，记录以上四种等位基因在他们中的分布情况。结果①HLA-DQA1*0201与皖籍汉族银屑病患者具有明显的相关性（Pc=0．0000191，OR-8．47）；②HLA1-DQA1*0103在无家族史患者中出现的频率较高（P=0．019）。结论①HLA-DQA1*0201可能是银屑病的易感基因或与易感基因相连锁；②有家族史与无家族史患者在其遗传基础上可能存在差异。

HLA-DQ/DP等位基因与粤籍汉族斑秃及中医证型的相关性研究

目的探讨HLA-DQ/DP等位基因与粤籍汉族斑秃及中医证型的相关性。方法采用聚合酶链反应-序列特异性引物(PCR-SSP)分型技术,对51例粤籍汉族斑秃患者的HLA-DQ/DP等位基因进行检测,并与110名粤籍汉族健康人群进行对照。结果 HLA-DQA1*0201、DQA1*0601、DQB1*0501、DQB1*0602、DPA1*0103基因频率斑秃组显著高于对照组,有极显著性差异(P<0.05或P<0.01);DQB1*0301、DPA1*0201基因频率斑秃组显著低于对照组(P<0.05);DQA1*0301气血两虚证基因频率显著高于其他证型(P<0.05)。结论 HLA-DQA1*0201、DQA1*0601、DQB1*0501、DQB1*0602、DPA1*0103可能是斑秃的易感基因,DQB1*0301、DPA1*0201可能是斑秃的保护基因,DQB1*0301主要与重型组有关,DQB1*0501、DPA1*0103则与轻型组相关,DQA1*0301可能是气血两虚证的易感基础。

HLA-C基因分型与皖籍汉族人寻常性银屑病关系的研究

目的 探讨皖籍汉族人寻常性银屑病 (PsV )与HLA C等位基因的相关性。方法 运用聚合酶链反应 -序列特异性引物 (PCR SSP)法 ,对 166例皖籍PsV患者和 2 48例健康对照进行HLA C基因分型。结果 ①PsV患者组HLA Cw 0 60 2等位基因频率较对照组显著升高 (OR =4.13 ,95 %可信限 2 .3 8～ 7.16,Pc <0 .0 1) ,但HLA Cw 0 3 0 4等位基因频率则较对照组明显减低 (OR =0 .3 2 ,95 %可信限 0 .17～ 0 .60 ,Pc <0 .0 1) ;②早发型PsV (I型银屑病 )及有PsV家族史患者携带HLA Cw 0 60 2等位基因频率分别高于迟发型PsV (II型银屑病 )及无PsV家族史患者 (OR =4.3 2 ,95 %可信限 2 .44～ 7.67,Pc <0 .0 1和OR =13 .2 8,95 %可信限 6.12～ 2 9.11,Pc <0 .0 1)。结论 皖籍汉族人PsV与HLA Cw 0 60 2等位基因高度关联 ,且携带该等位基因的个体易发生早发型银屑病 ,并有家族倾向性。