枸橘苷抑制血管生成作用的研究

目的研究传统中药枸橘主要成分之一枸橘苷对血管生成的抑制及初步的作用机制。方法用四甲基偶氮唑盐(MTT)法、黏附抑制试验、迁移抑制实验及体内鸡胚绒毛尿囊膜法(CAM法)研究枸橘苷体外抗血管生成作用;用逆转录聚合酶链反应(RT-RCR)方法检测枸橘苷对肿瘤细胞血管内皮生长因子A(VEGF-A)mRNA表达的影响。结果枸橘苷对血管内皮细胞增殖表现出良好的抑制作用,IC50值为(27.8±0.2)μmol·L-1,优于其抑制肿瘤细胞增殖的能力[IC50≥(33.8±0.1)μmol·L-1];在体外该化合物能够明显抑制内皮细胞的黏附和迁移作用,同时体内实验显示该化合物在30μg剂量浓度时能够显著抑制鸡胚绒毛尿囊膜新生血管形成;RT-RCR实验显示枸橘苷在12.5μmol·L-1和25μmol·L-1剂量时显著抑制A549细胞的VEGF-A mRNA表达,且结果具有显著的差异。结论枸橘苷具有抑制新生血管形成作用,其作用机制可能与与抑制血管内皮细胞增殖以及降低肿瘤细胞表达VEGF的量有关。

高效液相色谱法对枳实提取物中黄酮类药效组分的定量分析

目的:建立同时对枳实提取物中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和枸橘苷进行定量分析的HPLC方法。方法:采用BDS液相色谱柱(5μm,4.6mm×250mm),流速1mL/min,检测波长283nm,流动相条件为乙腈和0.05%磷酸水梯度洗脱系统。0～5min为乙腈:0.05%磷酸水(19:81);5～45min之间乙腈由19%等度梯度上升至40%。结果:柚皮苷在0.03200～0.07466μg(r=0.9995),橙皮苷在0.00095～0.00475μg(r=0.9994),新橙皮苷在0.04888～1.4664μg(r=0.9993),枸橘苷在0.01700～0.34900μg(r=0.9999)之间线性关系良好;精密度和重现性试验中待测的各黄酮类组分RSD值均小于2%;稳定性试验中样品在32h内各黄酮类组分RSD值均小于3%;柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和枸橘苷的加样回收率结果分别为100.51%(RSD=2.90%,n=5)、99.86%(RSD=2.79%,n=5)、102.83%(RSD=2.17%,n=5)、98.86%(RSD=1.97%,n=5)。结论:检测方法稳定,精密度、重现性和回收率好,可作为控制枳实提取物质量的依据之一。

HPLC一测多评法同步测定玳玳果黄酮降脂提取物4个效应组分含量

目的建立HPLC一测多评法(QAMS)同步测定玳玳果黄酮降脂提取物4个效应组分柚皮苷、新橙皮苷、橙皮内酯水合物、枳属苷含量。方法采用高效液相色谱法,选择主成分柚皮苷为内参物,建立HPLC一测多评法,并与HPLC外标法同时测定的4个组分含量结果比较。色谱柱Lichrocart C18柱(250 mm×4.6 mm,5μm),乙腈(A)-0.2%冰醋酸水溶液(B)为流动相,梯度洗脱;流速1.0 m L/min,检测波长284 nm;柱温30℃;进样量10μL。结果玳玳果黄酮降脂提取物柚皮苷、新橙皮苷、橙皮内酯水合物、枳属苷的质量浓度分别在31.377~159.188μg/mL(r=0.999 5)、63.632~208.123μg/m L(r=0.999 8)、3.899~12.241μg/m L(r=0.999 6)、2.696~17.366μg/mL(r=0.999 4)范围内呈良好的线性关系;平均回收率(n=6)分别为97.99%、101.50%、98.21%、95.56%,RSD分别为2.07%、2.80%、2.92%、2.32%。结论以柚皮苷为内参物,HPLC一测多评法同步测定玳玳果黄酮降脂提取物4个效应组分含量结果准确,可用于玳玳果黄酮降脂提取物多指标质量监控。

绿衣枳壳中枳属苷的提取工艺研究

目的优选绿衣枳壳中枳属苷的最佳提取工艺。方法高效液相色谱法测定绿衣枳壳中枳属苷的含量,以枳属苷的含量为指标,应用单因素试验结合正交试验法优化绿衣枳壳中枳属苷的提取工艺。结果绿衣枳壳中枳属苷的最佳提取工艺为加入6倍量90%乙醇,提取3次,每次1 h。结论该提取工艺方法简单、稳定可行,可以为绿衣枳壳中枳属苷的大规模化生产工艺提供理论依据。

枸橘苷对胃癌细胞抑制作用及其机制研究

目的:探究枸橘苷对AGS胃癌细胞抑制作用及其机制。方法:MTT实验检测枸橘苷对AGS细胞活力的影响;流式细胞术分析细胞周期分布以及细胞凋亡;细胞核染色分析AGS细胞在枸橘苷处理之后的形态学变化;Western blot检测枸橘苷对AGS细胞中外源性凋亡通路相关蛋白FasL、caspase-8、caspase-3和PARP,以及内源性凋亡相关蛋白Bak、Bcl-xL、Bax和caspase-9蛋白水平的影响。结果:MTT实验表明枸橘苷抑制AGS胃癌细胞活力,并且呈时间、剂量依赖性(P<0.05);流式细胞术分析结果表明枸橘苷使细胞停滞在G_1期,凋亡数量增加(P<0.05);核染色结果说明,与对照组相比,150μmol/L枸橘苷处理后细胞核明显浓缩,细胞凋亡数量增加;Western blot实验表明枸橘苷上调FasL,激活caspase-8和caspase-3,促使活化的caspase-3底物PARP切割(P<0.05),而对线粒体调节的内源性凋亡通路相关蛋白没有影响。结论:枸橘苷通过激活外源性凋亡通路促使AGs细胞凋亡,抑制胃癌细胞增殖,从而发挥抗肿瘤作用,在临床上可能成为治疗胃癌的新型药物。

枸橘苷对人骨肉瘤U-2 OS细胞的抑制作用

目的探讨枸橘苷对人骨肉瘤U-2 OS细胞的抑制作用。方法分别以0,5,10,20,40,80,160μmol/L的枸橘苷处理U-2 OS细胞,检测细胞活力并计算枸橘苷对U-2 OS细胞的半数抑制浓度(IC_(50));U-2 OS细胞实验分为空白对照组[等体积磷酸盐缓冲液(PBS)]和枸橘苷高、低剂量组(52,26μmol/L),慢病毒转染细胞实验分为枸橘苷组(A组,52μmol/L)、空白对照组(B组,等体积PBS)、枸橘苷对照组(C组,52μmol/L+50 MOI pLVX-EGFP-C1)、枸橘苷+FBXO2组(D组,52μmol/L+50 MOI pLVX-EGFP-C1-FBXO2)。采用CCK-8法检测细胞活力,集落形成实验检测细胞增殖情况,反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测细胞FBXO2 mRNA表达水平,Western blot法检测细胞FBXO2,LC3Ⅰ,LC3Ⅱ,Beclin1,p62,p-STAT3,STAT3蛋白表达水平。结果枸橘苷对U-2 OS细胞的IC_(50)为52.08μmol/L。与空白对照组比较,枸橘苷高、低剂量组细胞在24,48,72 h时的细胞活力显著减弱(P<0.05),克隆形成数显著减少(P<0.05),LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin1蛋白表达水平显著升高(P<0.05),p62蛋白表达水平、FBXO2 mRNA和蛋白表达水平、p-STAT3/STAT3均显著降低(P<0.05);与C组比较,D组细胞在24,48,72 h时的活力显著增强(P<0.05),克隆形成数显著增加(P<0.05),LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin1蛋白表达水平均显著降低(P<0.05),p62蛋白表达水平、FBXO2 mRNA和蛋白表达水平、p-STAT3/STAT3均显著升高(P<0.05)。结论枸橘苷可抑制U-2 OS细胞的增殖,并促进其自噬,其机制可能与抑制FBXO2的表达从而抑制STAT3通路激活有关。

多溶剂萃取法分离制备绿衣枳壳中枳属苷

目的建立一种从绿衣枳壳中快速分离制备高纯度枳属苷的方法。方法采用多溶剂萃取法将枳属苷从绿衣枳壳乙酸乙酯萃取部分粗提物中分离出来,并通过多次试验优化了多溶剂萃取法条件,枳属苷最佳分离实验条件为:萃取溶剂V(甲醇):V(氯仿)=6:5,分相液为水,V(萃取溶剂):V(分相液)=11:4。结果该法所得的枳属苷单体,经HPLC峰面积归一化法计算其纯度均不低于98%。结论多溶剂萃取法是一种简单。高效的分离制备绿衣枳壳中枳属苷的方法。

基于文献分析和分子对接法探讨化橘红防治新型冠状病毒肺炎(COVID-19)的前景

目的探讨化橘红防治新型冠状病毒肺炎(COVID-19)的前景,为化橘红的临床应用提供依据。方法通过文献查阅,对化橘红及其主要化学成分在祛痰、抗急性肺损伤、抗炎、抗肺纤维化、镇咳、抗氧化、抗肝损伤和抗肾损伤等方面的药理作用进行分析,并通过中药系统药理学平台(TCMSP)和查阅文献检索化橘红的化学成分,将各化学成分与血管紧张素转化酶Ⅱ(ACE2)、3CL水解酶(Mpro)、木瓜样蛋白酶(PLP)和树突状细胞特异性细胞间黏附分子-3结合非整合素因子(DC-SIGN)进行分子对接,预测其在抑制新型冠状病毒(SARS-Co V-2)病毒感染和复制方面的潜在活性。结果文献分析结果表明,化橘红及其主要化学成分具有祛痰、抗急性肺损伤、抗炎、抗肺纤维化、镇咳、抗氧化、抗肝损伤和抗肾损伤等多方面药理活性;分子对接结果表明,柚皮苷(naringin)、新橙皮苷(neohesperdin)、野漆树苷(rhoifolin)、枸橘苷(poncirin)和西托糖苷(sitogluside)与ACE2、MPro、PLP和DC-SIGN均具有较强的结合力,具有抑制SARS-CoV-2病毒感染宿主细胞和自我复制的潜在活性。结论化橘红既具有通过多种药理活性改善COVID-19病程进程的潜力,又可能通过作用于ACE2、MPro、PLP和DC-SIGN发挥抑制病毒感染宿主细胞及自我复制的作用。提示化橘红可能对COVID-19的防治具有积极作用。

一测多评法同时测定玳玳果黄酮滴丸中4个活性成分的含量

目的：建立一测多评法同时测定玳玳果黄酮滴丸中活性成分柚皮苷、新橙皮苷、橙皮内酯水合物及枳属苷的含量。方法：采用高效液相色谱法,使用250-4 lichrocart C18（250 mm×4.6 mm,5μm）色谱柱,流动相为乙腈（A）-0.2%醋酸水溶液（B）,线性梯度洗脱（0-10 min,22%A;10-20 min,22%A→35%A;20-25 min,35%A→48%A;25-30 min,48%A→22%A）,流速1.0 m L·min-1,检测波长284 nm,柱温25℃,进样量20μL。柚皮苷、新橙皮苷、橙皮内酯水合物及枳属苷的色谱峰分离度R〉1.5,理论塔板数按柚皮苷计〉3 000。建立测定代表性成分柚皮苷含量并以其为内参物,通过柚皮苷与新橙皮苷、橙皮内酯水合物和枳属苷的相对校正因子计算新橙皮苷、橙皮内酯水合物和枳属苷含量的一测多评法,实现多指标成分的同步测定;同时与外标法分别测定玳玳果黄酮滴丸上述4个成分含量的结果比较。结果：柚皮苷质量浓度在119.40-477.60μg·m L-1、新橙皮苷质量浓度在122.20-488.80μg·m L-1、橙皮内酯水合物质量浓度在7.62-22.86μg·m L-1、枳属苷质量浓度在3.00-21.00μg·m L-1范围内线性关系良好;柚皮苷、新橙皮苷、橙皮内酯水合物、枳属苷平均加样回收率（n=3）分别为98.67%（RSD=1.5%）、98.20%（RSD=0.50%）、101.9%（RSD=1.7%）、100.9%（RSD=0.35%）;柚皮苷与新橙皮苷、橙皮内酯水合物、枳属苷的相对校正因子分别为1.153、0.434、0.893,RSD（n=6）分别为2.7%、3.1%、1.2%;外标法与一测多评法含量测定结果无显著性差异。结论：以柚皮苷为内参物,利用相对校正因子一测多评法同时测定玳玳果黄酮滴丸活性成分柚皮苷、新橙皮苷、橙皮内酯水合物与枳属苷含量的结果准确,为以中药有效部位为原料制备的中药制剂实现多指标成分群质量控制评价提供了可借鉴的方法。

正交试验优选枸橘的提取工艺

目的:对枸橘的提取工艺进行优选。方法:以乙醇浓度、提取时间、溶剂倍数为考察因素,枸橘苷、欧前胡素的转移率为评价指标,运用正交试验优化提取的最佳工艺条件,同时用方差分析对其进行评价。结果:枸橘最佳提取工艺条件为70%乙醇溶液提取两次,第1次6倍量,提取60 min,第2次4倍量,提取45 min。结论:优选出的提取工艺简单、科学、合理,为枸橘的开发利用奠定基础。

HPLC法同时测定绿衣枳壳中3种黄酮类化合物的含量

目的：建立HPLC法同时测定绿衣枳壳中柚皮苷、橙皮苷及枳属苷的含量。方法：采用Hypersil ODS2（250 mm×4.6mm,5μm）色谱柱,以乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）为流动相,梯度洗脱（0~15 min,20%A;15~17 min,20%A→30%A;17~27 min,30%A）,流速1.0 m L·min-1,检测波长283 nm。结果：柚皮苷、橙皮苷及枳属苷进样量分别在0.080~2.667、0.033~1.088、0.090~3.013μg范围内呈良好线性关系（r=0.999 6~0.999 9）;各组分平均回收率（n=3）在99.63%~101.5%之间,RSD为0.040%~1.2%。10批样品测定结果为柚皮苷含量1.62%~2.02%,橙皮苷含量0.045%~0.063%,枳属苷含量1.66%~1.90%。结论：本法可用于同时测定绿衣枳壳中柚皮苷、橙皮苷及枳属苷的含量。

枳壳HPLC特征图谱及6个黄酮苷类成分含量测定

目的:采用高效液相色谱法建立枳壳的特征图谱,并同时测定6个黄酮苷类成分的含量。方法:以新北美圣草苷、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和枳属苷为指标性成分,采用Kinetex?2.6μC18 100(100 mm×4.6 mm,2.6μm)色谱柱,以乙腈为流动相B,0.1%甲酸为流动相A,梯度洗脱(0~10 min,15%B→15%B;10~15 min,15%B→20%B;15~20 min,20%B→25%B;20~30 min,25%B→40%B),流速1.0 mL·min-1,检测波长为283 nm,柱温30℃。结果:建立枳壳特征图谱,30 min内枳壳的主要色谱峰能够达到完全分离,同时标定6个黄酮苷类成分,对12批饮片中的6个成分进行含量测定。新北美圣草苷、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和枳属苷的质量浓度分别在1.77~70.8μg·mL-1(r=0.999 8,n=5)、11.3~452.0μg·mL-1(r=1.000 0,n=5)、34.0~1 360μg·mL-1(r=0.999 9,n=5)、13.6~544μg·mL-1(r=1.000,n=5)、27.6~1 104μg·mL-1(r=0.999 6,n=5)、 14.9~596μg·mL-1(r=1.000,n=5)范围内线性关系良好,方法的平均回收率(n=6)分别为96.9%(RSD=1.8%)、104.6%(RSD=1.7%)、97.4%(RSD=1.11%)、107.4%(RSD=1.1%)、93.2%(RSD=1.1%)、107.8%(RSD=1.5%);12批枳壳中上述6个成分含量分别为0.11%~0.45%、0.17%~0.59%、4.85%~9.09%、0.37%~0.74%、3.24%~6.17%、0.05%~0.56%。结论:该方法操作简单,重复性好,并能同时测定6个黄酮苷类成分含量,可为枳壳的质量标准研究提供更加全面的依据。

温胆汤UPLC-UV-MS/MS指纹图谱研究

目的研究和建立温胆汤UPLC-UV指纹图谱,确定色谱峰药材来源,同时对各成分进行定性研究,为该方物质基础和质量控制提供科学依据。方法 UPLC-UV法进行温胆汤指纹图谱研究,对14批样品进行相似度分析;阴性液对照法进行共有峰药材来源研究;UPLC-MS/MS法对温胆汤中成分进行定性研究。结果建立了温胆汤UPLC-UV指纹图谱,进行了方法学考察,结果显示该方法精密度、稳定性、重复性良好;对14批样品进行指纹图谱研究,得出共有峰指纹图谱,标记了22个共有峰;进行了14批样品相似度比较,相似度在0.863~0.998;通过与对照品保留时间比较,直接指认了橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷、甘草苷和甘草酸铵;与药材阴性液比较,对22个共有峰药材来源进行了归属;UPLC-MS/MS法定性了橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷、甘草苷和甘草酸铵5个成分,推断出了圣草枸橼苷、异柚皮苷、枸橘苷、乌拉尔甘草皂苷乙4个成分。结论建立的指纹图谱方法准确、可靠,对温胆汤物质基础和质量控制研究提供了一定参考。

基于AHP-熵权法结合正交试验设计优选岭南特色饮片制枳壳的发酵工艺及发酵前后成分对比研究

目的 建立枳壳发酵品中多个成分的含量测定方法,优化岭南特色饮片制枳壳的发酵工艺,并比较枳壳发酵前后的成分变化。方法 通过UHPLC测定枳壳发酵品中特征成分含量,在单因素实验的基础上,采用正交试验法考察发酵温度、发酵时间、发酵湿度等影响因素,以枳壳发酵品中的10种特征黄酮类成分(包括黄酮苷及苷元)的含量和发酵品的外观性状作为指标,采用层次分析法(analytic hierarchy process,AHP)结合熵权法对这些指标设置不同的权重,并计算复合评分来优选其发酵工艺。结果 枳壳的最佳发酵工艺为浸泡时间4 h,发酵时间48 h,发酵温度37℃,发酵湿度90%;枳壳发酵后,黄酮苷类成分的含量下降,黄酮单糖苷和苷元类成分的含量均大幅度增加。结论 建立的UHPLC多成分含量测定方法操作简单、准确,优选的枳壳发酵工艺简便、稳定可行,可规范枳壳的发酵工艺,为制枳壳的工业化生产奠定基础。

UPLC-Q-TOF-MS联用研究不同厂家前列癃闭通片指纹图谱

目的通过建立前列癃闭通片(Qianlielong Bitong Tablets,QBT)的UPLC指纹图谱,考察了9个厂家58批次QBT的质量,为完善该制剂的质量控制奠定基础。方法采用UPLC法,色谱柱Eclipse Plus C18 RRHD(50 mm×2.1 mm,1.8μm);流动相为乙腈-0.1%甲酸水溶液,梯度洗脱,采用全时段多波长融合技术,体积流量0.3 mL/min;柱温30℃。建立QBT的指纹图谱,并对各样品的指纹图谱进行相似度评价,结合聚类分析评价58批样品的质量,指认了指纹图谱中主要共有峰的化学成分并确定了其药材归属。结果首次建立QBT的UPLC指纹图谱,对其中16个共有峰进行了化学成分鉴定,分别是辛弗林(1号峰)、虎杖苷(2号峰)、金丝桃苷(3号峰)、新圣草苷(4号峰)、柚皮苷(5号峰)、橙皮苷(6号峰)、新橙皮苷(7号峰)、枸橘苷(8号峰)、朝藿定A(9号峰)、朝藿定B(10号峰)、朝藿定C(11号峰)、淫羊藿苷(12号峰)、芒柄花素(13号峰)、宝藿苷(14号峰)、大黄素(15号峰)、大黄素甲醚(16号峰),确定了16个特征峰来源于方中4味中药,峰1、4~8归属枳壳药材,峰2、3、15、16归属虎杖药材,峰9~12、14归属淫羊藿药材,峰13归属黄芪药材。对9个生产企业58批次样品进行相似度评价,相似度分布在0.600~0.912,通过聚类分析大致可聚为4类。结论建立QBT的指纹图谱,该方法简便、可靠,为进一步评价和监测QBT的质量提供参考。

HPLC法测定酸橙枳壳和枸橘枳壳中黄酮苷的含量

目的:建立酸橙枳壳和枸橘枳壳中异柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和枳属苷同时测定的HPLC方法。方法:采用Dikma C_(18)(2)柱(150 mm×4.6 mm,5μm),以乙腈(A)-0.1%磷酸水(B)为流动相,梯度洗脱(0~10 min,20%A;10~11 min,20%A→30%A;11~25 min,30%A),流速1.0 m L·min^(-1),检测波长283 nm,柱温25℃。结果:异柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和枳属苷进样量分别在0.864 0~6.912μg(r=0.999 5)、418.0~3 344μg(r=0.999 1)、18.21~145.6μg(r=0.999 6)、422.1~3 376μg(r=0.999 7)、204.2~1 633μg(r=0.999 1)的范围内呈良好的线性关系;平均回收率(n=6)分别为102.5%、99.60%、101.4%、100.1%和99.61%,其RSD分别为1.5%、2.1%、1.9%、0.34%和0.23%。17批酸橙枳壳中异柚皮苷含量均为0.01%,柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和枳属苷的含量范围分别为5.73%~12.2%、0.10%~0.61%、2.18%~7.27%和1.03%~1.90%。9批枸橘枳壳中异柚皮苷含量均为0.02%;柚皮苷和枳属苷含量范围分别为1.90%~7.34%和1.11%~4.14%;部分枸橘枳壳中橙皮苷含量低于定量限,最高为0.40%;新橙皮苷含量均低于定量限。酸橙枳壳中柚皮苷和新橙皮苷含量与枸橘枳壳相比均较高,异柚皮苷、橙皮苷和枳属苷含量与枸橘枳壳相比均较低。结论:本法可用于酸橙枳壳和枸橘枳壳中异柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和枳属苷的含量测定。

基于HPLC-Q-TOF-MS及化学模式识别方法对陈皮的化学成分快速鉴别及产地判别研究

目的 研究不同产地陈皮Citri Reticulatae Pericarpium化学成分的差异,结合化学模式识别方法对陈皮的产地进行判别分析。方法 采用Agilent SB-C_(18)(150 mm×3.0 mm,2.7μm)色谱柱分离,以乙腈-0.1%甲酸水溶液进行梯度洗脱,质谱采用电喷雾离子源,在正离子模式下采集数据。对色谱图中各色谱峰进行精确质量数识别,利用二级质谱裂解规律、PCDL数据库及对照品对化学成分进行定性分析。结合主成分分析、聚类分析、判别分析等多元统计方法分析了新会陈皮与其他不同产地陈皮的差异成分,并利用这些分析方法鉴别了未知产地陈皮的来源。结果 从不同产地陈皮中鉴定出了29个共有化学成分,主要为多甲氧基黄酮及黄酮苷类化合物。建立9个差异化学成分的判别模型,实现了新会陈皮的准确判别,准确率达94.4%。结论 可作为陈皮产地鉴别和质量控制的有效方法,为道地药材新会陈皮的判别提供参考。