鸭坦布苏病毒prM蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位鉴定

为制备鸭坦布苏病毒(DTMUV)膜前体蛋白(prM)的单克隆抗体,将原核表达的重组prM蛋白配伍佐剂免疫6周龄雌性BALB/c小鼠,3次免疫后分离小鼠脾细胞并将其与SP2/0细胞进行融合,通过间接ELISA筛选,获得2株能稳定分泌抗DTMUV prM蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为3H4和5C10。2株杂交瘤细胞均能稳定分泌抗体,制备的腹水抗体效价分别为1∶51200和1∶102400。亚型鉴定结果显示,3H4和5C10单克隆抗体的重链均属于IgG2b,轻链均为Kappa型。Western blot和间接免疫荧光试验结果显示,这2株单克隆抗体均能与BHK-21细胞中感染的DTMUV发生特异性反应,而与同属的日本脑炎病毒无交叉反应。微量病毒空斑减少中和试验结果表明,这2株单克隆抗体均具有中和活性。进一步原核表达prM蛋白不同截短体,发现2株单抗针对不同表位,均位于prM蛋白的pr片段上。本研究制备的单克隆抗体3H4和5C10为快速检测DTMUV感染和研究prM蛋白的结构与功能奠定了基础。

玉米病程相关蛋白(PRm)的研究进展

本文对玉米病程相关蛋白的诱导与生物学特性、在植物抗病性中的作用和分布及在分于生物学等方面的研究进展进行了综述，并对今后研究重点作以展望。

蜱传脑炎病毒prM-E蛋白的真核表达及其在荧光素酶免疫共沉淀技术中的应用？

为了探索一种新型的血清学技术的荧光素酶免疫共沉淀技术（LIPS），本研究利用真核表达系统制备了蜱传脑炎病毒结构蛋白prM-E与荧光素酶融合蛋白，并评价了其在LIPS系统中的检测效果。首先以蜱传脑炎病毒RNA为模板，采用RT-PCR技术扩增prM-E抗原基因，连接到pNLF1-secN质粒上构建真核表达载体pNLF-prM-E，使prM-E蛋白与荧光素酶串联融合表达，并将该质粒转染到Cos7细胞中。结果显示，转染重组质粒pNLF-prM-E的细胞上清中可检测到荧光素酶的高表达；进而用间接免疫荧光试验（ IFA）检测到转染的细胞与蜱传脑炎病毒抗体特异性结合；在此基础上，用LIPS方法对蜱传脑炎病毒感染患者血清进行检测，从20份患者血清中检出19份阳性，7份对照血清均为阴性。结果表明该重组抗原具有良好的特异性和灵敏性，可以用于LIPS系统中的候选检测抗原。

在昆虫细胞中表达西尼罗河病毒prM+E蛋白

采用PCR技术扩增prM+E基因,将其插入到供体质粒pFast-Bac1中得到重组质粒Pfast-Bac1-W-PE,之后转化大肠杆菌DH10-Bac,构建包含西尼罗河病毒prM+E基因的重组杆状病毒,然后感染正常的sf9细胞,收集感染不同时间段的细胞及上层培养基。结果表明:在感染后的第1天目的基因就得到了转录,同时有少量的重组杆状病毒释放到培养基中;SDS-PAGE和Western-Blot检测结果显示,在43.0ku与66.0ku条带之间,感染细胞裂解液较正常细胞的裂解液多出一条带,该蛋白为WNV完整的E蛋白,而且这一差异蛋白能与WNV兔多抗反应。

登革病毒prM抗体的中和作用及ADE作用研究

【目的】研究登革病毒(DENV)前膜蛋白(pr M)多克隆抗体对不同型别登革病毒的中和作用和抗体依赖性感染增强作用(ADE),为进一步阐明pr M蛋白在登革病毒致病与免疫过程中的重要作用提供依据。【方法】采用ELISA方法检测登革热患者血清中是否存在pr M抗体;用重组登革病毒2型(DENV-2)pr M蛋白免疫家兔,制备pr M蛋白多克隆抗体;采用空斑减数中和试验和流式细胞术检测pr M抗体对4种血清型登革病毒(DENV-1、DENV-2、DENV-3、DENV-4)的中和作用及ADE作用。【结果】登革热患者血清中存在特异性pr M抗体;pr M抗体对4种血清型登革病毒只有部分中和作用,但在一定浓度范围内对DENV1-4型均有明显的感染增强活性,且对异型DENV的感染增强作用强于同型,其中对登革病毒2型未成熟颗粒(im DENV-2)的感染增强作用最为明显。【结论】登革热患者血清存在pr M特异性抗体;pr M抗体对不同血清型DENV均只有较弱的中和活性,但却呈现出较强的ADE效应,证明登革病毒pr M抗体是一种感染增强性抗体。

流行性乙型脑炎prM蛋白剪切位点突变的prM-E蛋白表达细胞系的建立

为建立稳定共表达乙型脑炎病毒(JEV)完整M前体蛋白(prM)和E蛋白的BHK-21细胞系,本研究在prM蛋白furin蛋白酶剪切位点编码基因中引入突变,将突变后的prM基因克隆于质粒中构建重组表达质粒pCAG-JEV-prM(R89A)E。将重组质粒转染BHK-21细胞,转染48 h后细胞用含G418的选择性培养基选择培养,进一步经细胞克隆纯化制备表达剪切位点突变的JEV prM-E蛋白的稳定细胞系。经IFA和western blot鉴定表明,该细胞系能表达JEV prM与E蛋白,所表达的prM蛋白未发生剪切;细胞经多次传代后仍能够稳定地共表达prM与E蛋白。该细胞系的建立为研究prM蛋白剪切对JEV粒子形成的影响以及亚单位疫苗的制备奠定了基础。

表达西尼罗病毒囊膜糖蛋白PrM/E重组新城疫病毒的构建及其免疫原性研究

西尼罗病毒(WNV)是一种可以导致人与动物死亡的人兽共患病的虫媒病毒。为构建表达WNV Pr M/E蛋白的重组新城疫病毒(NDV)La Sota疫苗株并对其免疫原性进行评价,本研究利用反向遗传学操作技术将人工合成的WNV pr M/E基因插入至NDV基因组P和M基因之间,构建重组病毒r La-WNV-Pr M/E。以重组病毒分别感染BHK-21细胞和免疫小鼠,利用RT-PCR、间接免疫荧光、ELISA和流式细胞术(FACS)检测Pr M/E蛋白的表达情况及免疫效果。结果显示,WNV-Pr M/E蛋白在BHK-21细胞中获得正确表达,免疫小鼠可以诱导其产生高水平的抗Pr M/E蛋白特异性Ig G,并且诱导产生WNV E蛋白表位特异性CD4+和CD8+T细胞免疫反应。以上结果表明本研究构建的r La-WNV-Pr M/E可以作为一种具有前瞻性和储备性且安全有效的西尼罗热防控候选疫苗,对我国应对该病的潜在威胁具有十分重要的意义。

猪乙型脑炎PrM-E重组腺病毒的构建及免疫原性

应用RT-PCR方法扩增出猪乙型脑炎病毒的PrM-E基因,经序列测定正确后,通过SalⅠ和EcoRⅠ酶切位点把该基因插入经过同样双酶切的穿梭质粒pDC315中,获得重组穿梭质粒pDC315-PrM-E。重组穿梭载体经过酶切和PCR鉴定后进行测序,证明所插入的基因是正确的。将获得的重组穿梭质粒与腺病毒骨架质粒pBHGlox-E1.3Cre共转化293细胞获得重组腺病毒Ad-PrM-E。经PCR鉴定证明所构建的重组腺病毒含有PrME基因。小白鼠免疫28 d后进行间接ELISA检测证明所构建的重组腺病毒在小白鼠体内能够诱导产生抗JEV的抗体,阳转率90%。

寨卡病毒包膜蛋白重组人腺病毒5型载体的构建与免疫原性测定

目的以腺病毒5型载体(Ad5)构建含寨卡病毒(ZIKV)包膜蛋白(prM-E)的复制缺陷型5型重组腺病毒(rAd5)表达载体,测定prM-E在细胞中的表达及对小鼠的免疫原性。方法从ZIKV毒株Z16006(亚洲型)分离获得prM-E基因片段,以重组腺病毒AdMaxTM系统包装重组腺病毒rAd5/prM-E。选用C57BL/6小鼠,以rAd5/prM-E107、108和109 PFU三个剂量肌内注射免疫小鼠,在第3周同等剂量加强免疫一次,第5周从小鼠眼球取血并分离脾淋巴细胞。分别以ELISpot和ELISA方法测定小鼠对ZIKV prM-E的体液与细胞免疫反应。结果成功构建复制缺陷型重组腺病毒载体rAd5/prM-E,采用Western blot方法和抗ZIKV E抗体检测rAd5/prM-E感染的293A细胞表达产物,可见与E蛋白相应的56 kDa蛋白带。以ELISpot方法测定小鼠脾淋巴细胞特异性IFN-γ分泌细胞形成斑点数(SFCs),结果分别为(688.54±186.43)、(1 084.90±144.14)和(1 640.20±147.13)SFCs/106脾细胞,与病毒接种剂量呈正比关系;采用ELISA测定免疫小鼠血清中抗E抗体,其滴度(log10值)分别为(3.14±0.39)、(3.50±0.30)和(3.74±0.25),均高于对照组小鼠(0.80±0.17),差异具有统计学意义(P<0.001)。结论 rAd5/prM-E具有感染小鼠并诱导小鼠产生强烈的特异性抗体和细胞免疫反应的能力,表明prM-E具有良好的免疫原性,为ZIKV候选疫苗研制提供了可靠的免疫源。

基于高分辨质谱技术的婴幼儿食品中过敏原蛋白质的高灵敏检测

基于高效液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)技术,选择稳定性好、灵敏度高的特征肽段,利用平行反应监测(PRM)技术,实现了多类过敏原蛋白质的高灵敏度同时检测,并成功应用于婴幼儿食品中过敏原成分的分析。对于婴幼儿食品中蛋白质的提取,与传统的丙酮沉淀法比,采用膜上原位样品预处理方法(i-FASP)可实现更高的蛋白质提取效率和抗干扰能力。所检测的过敏原蛋白质的定量限(LOQ)最小可达到0.028 mg/L,其线性范围最宽可跨越4个数量级,且线性关系良好(相关系数R^2≥0.99)。该方法为食品中过敏原蛋白质组学快速分析提供了一种可靠的分析方法。

登革病毒2型prM蛋白的表达及其抗体的ADE作用研究

目的建立登革病毒2型(DENV-2)前膜蛋白(prM)的原核稳定表达系统,并制备prM多克隆抗体,研究登革病毒特异性prM抗体的中和作用及抗体依赖性感染增强作用(ADE)。方法应用大肠杆菌表达系统表达全长DENV-2 prM蛋白,经电洗脱法纯化重组蛋白,免疫家兔,制备兔抗prM蛋白多抗;应用空斑减数中和试验(PRNT)和流式细胞术(FCM)分别检测prM兔多克隆抗体的中和作用和ADE效应。结果重组prM蛋白在原核系统可获得高效表达,prM蛋白的表达量占大肠杆菌全菌蛋白的15%左右;其免疫血清经Western blotting法证实为登革病毒特异性prM多克隆抗体,用ELISA法检测效价为1:800 000。PRNT表明,prM抗体对成熟和不成熟DENV-2感染C6/36细胞中和作用有限,最大中和程度分别为49.84%和50.22%;FCM结果表明,prM抗体能在较大的抗体稀释度范围(10-2～10-6)增强成熟和不成熟DENV-2感染,且在10-3稀释度时达到最高峰。结论重组DENV-2 prM蛋白有很强的免疫原性,其诱生的prM抗体对登革病毒仅有较弱的中和活性,但却呈现出较强的ADE作用,揭示prM抗体是一种感染增强性抗体。

寨卡病毒prM蛋白原核表达及其多克隆抗体制备

目的通过原核表达系统表达纯化寨卡病毒(zika virus,ZIKV)prM膜蛋白并制备该蛋白的多克隆抗体。方法在对寨卡病毒膜蛋白prM进行生物信息学分析的基础上,去除其跨膜域,对该蛋白的密码子进行优化,化学合成基因序列并连接到表达质粒pET32a,重组质粒转化E.coli.BL21(DE3),并对其进行测序,然后进行原核诱导表达,诱导产物进行SDS-PAGE鉴定并用His柱纯化。纯化的重组蛋白用于免疫BALB/c雌鼠,制备多克隆抗体,间接ELISA法和Western blot检测血清抗体效价及特异性。结果原核表达系统成功表达了截短prM蛋白,相对分子质量(Mr)为37×10~3,与预期相符。经过His柱纯化后获得高纯度的目的蛋白;该蛋白免疫BALB/c雌鼠后诱导产生特异性多克隆抗体,ELISA效价为1∶819 200;Western blot显示制备的多克隆抗体能性识别prM蛋白。结论利用原核表达系统高效表达并纯化了prM膜蛋白,制备的多克隆抗体效价高,特异性强,为进一步研究该病毒的致病机制及建立ZIKV感染快速诊断方法奠定了基础。

基于HPLC-Q-Exactive的PRM技术检测核桃露中核桃、杏仁、花生、大豆源性成分

应用高效液相色谱-四级杆/静电场轨道阱高分辨质谱的PRM技术,检测核桃露中核桃、杏仁和主要掺杂物种大豆、花生4种源性成分。从植物组织(核桃、杏仁、大豆和花生)提取的蛋白质,经还原、烷基化、胰蛋白酶酶解后,采用HPLC-Q-Exactive的Full MS-ddMS2(TopN)模式检测,数据经Proteome Discoverer软件与Uniprot蛋白数据库对比分析,筛选出各物种的特征肽段,然后根据这些肽标志物的质荷比和出峰时间建立HPLC-Q-Exactive-PRM检测方法,并使用Skyline软件对特征肽进行定量分析。结果表明:核桃露中核桃蛋白、杏仁蛋白、大豆蛋白和花生蛋白的最低检出限分别为10、30、20 mg/L和10 mg/L。经验证,该检测技术具有良好的专属性,比MRM技术更为准确、可靠,且有效消除了其他离子的干扰,为植物蛋白饮料物种来源鉴定提供了一种稳定、灵敏、可靠的检测技术。

乙型脑炎病毒DNA初免-蛋白加强策略在小鼠模型上的免疫效应评价

为了评价基因Ⅰ型乙型脑炎病毒prM-E DNA疫苗与prM和EⅢ融合抗原亚单位疫苗采用DNA初免-蛋白加强免疫策略对小鼠的免疫效果,本研究将prM-E融合基因插入到pVAX1真核表达载体中,构建重组表达载体prM-E-pVAX1作为DNA疫苗进行初免,利用原核表达系统获得的prM和EⅢ融合抗原作为亚单位疫苗进行加强免疫。将32只4-6周龄雌性BALB/c小鼠随机分成4组,设置prM-E-pVAX1 DNA疫苗组、DNA初免-蛋白加强免疫组、prM和EⅢ融合抗原亚单位疫苗组及pVAX1载体对照组,通过ELISA检测血清中特异性抗体水平;通过噬斑减少中和试验滴定中和抗体滴度;通过细胞因子表达丰度和淋巴细胞增殖试验分析不同疫苗免疫组诱导产生的细胞免疫反应。结果表明,用DNA初免-蛋白加强策略免疫的小鼠诱导产生的中和抗体滴度略高于prM和EⅢ融合抗原亚单位疫苗免疫组,显著高于prM-E-pVAX1 DNA疫苗免疫组。DNA初免-蛋白加强策略在小鼠模型中诱导产生了有效的Th1/Th2型免疫反应,特别是显著诱导了Th1型细胞免疫反应。本研究为预防流行性乙型脑炎提供了新的免疫策略和理论参考依据。