乙型肝炎病毒pre S基因真核表达质粒诱导小鼠特异性抗体反应的研究

本文构建了含有ＨＢｓＡｇ ｐｒｅ Ｓ区基因的真核表达载体ｐＣＭＶ４ｐｒｅ Ｓ， 经大量提取质粒并纯化后， 肌肉注射Ｂａｌｂ／ｃ 小鼠， 共免疫３ 次， 间隔两周， 结果有３／７ 的小鼠血清抗ｐｒｅ Ｓ２ 抗体呈阳性。

硅胶吸附纯化含Pre S蛋白的重组乙肝表面抗原的最佳洗脱条件

目的 确定重组乙肝表面抗原吸附于熔融硅胶后的最佳洗脱条件。方法 以表面抗原活性收率和纯度为考察指标 ,通过正交实验对影响表面抗原硅胶洗脱的主要因素 (pH值 ,盐浓度和表面活性剂浓度 )进行了研究。结果 pH值、盐浓度和表面活性剂浓度都对表面抗原收率有显著性影响 ,且pH值对表面抗原纯度有显著性影响。结论 用含 1mol·L-1氯化钠的0 .0 2 5mol·L-1碳酸钠缓冲液 (pH 10 )洗脱 ,表面抗原的收率和比活最优。

昆明地区HBsAg与抗-HBs双阳性慢性HBV感染患者流行病学调查及PreS/S基因突变特征

目的探讨昆明地区HBsAg与抗-HBs(Anti-HBs)双阳性乙型肝炎病毒(HBV)感染患者流行病学及PreS/S基因突变特征。方法选择2018年5月—2022年4月于云南大学附属医院住院及门诊定量检测乙肝两对半的438例慢性HBV感染患者为观察对象,将202例HBsAg(+)/抗-HBs(+)患者作为观察组,将236例HBsAg(+)/抗-HBs(-)患者作为对照组,对比两组患者临床特征。使用巢式聚合酶链反应扩增出PreS/S基因全长序列,确定基因型并分析PreS/S基因突变特征。结果观察组患者在<10岁及高于80岁人群中的流行率较高,而对照组在20~49岁人群中的流行率较高。与对照组比较,观察组患者年龄、HBsAg<250 IU/mL比例、C型HBV感染及乙肝携带者比例均显著增加(P<0.05)。成功扩增PreS/S并测序成功的观察组样本共132例,其中B型基因81例,C型基因51例;对照组样本中B型基因110例,C型基因65例。B型基因患者中,与对照组比较,观察组N末端区域突变率明显增加(P<0.05)。C型基因患者中,与对照组比较,观察组MHR、a决定簇及N末端区域突变率明显增加(P<0.05)。在观察组中,81例B型基因患者中PreS基因缺失突变14例(17.28%),51例C型基因患者中PreS基因缺失突变19例(37.25%),而在对照组中未发现PreS基因缺失突变。结论HBsAg/抗-HBs双阳性HBV感染者在<10岁及高于80岁HBsAg阳性人群多见,HBsAg/抗-HBs双阳性可能与HBsAg突变及PreS基因突变有关。

pre-S基因变异与乙型肝炎病毒感染患者肝功能和肝纤维化的相关性

目的 研究了pre-S基因变异与乙型肝炎病毒(HBV)感染患者肝功能和肝纤维化的相关性。方法 选取2019年12月至2022年6月该院收治的HBV感染者178例为研究对象,其中无症状HBV携带患者65例作为对照组,慢性乙型肝炎(CHB)患者70例作为CHB组,乙型肝炎肝硬化患者43例作为肝硬化组。比较对照组、CHB组、肝硬化组患者的pre-S基因变异情况、肝功能和肝纤维化指标水平。根据是否发生基因缺失变异,将HBV感染患者分为变异组和非变异组,比较变异组和非变异组的肝功能和肝纤维化指标水平。采用Spearman相关分析pre-S基因变异类型与患者肝功能和肝纤维化指标的相关性。结果 对照组和CHB组pre-S基因缺失变异率明显低于肝硬化组,CHB组pre-S基因缺失变异率明显低于肝硬化组,差异均有统计学意义(P<0.05)。对照组和CHB组ALT、AST、层粘连蛋白、透明质酸以及Ⅲ型前胶原肽水平明显低于肝硬化组,清蛋白水平明显高于肝硬化组,差异均有统计学意义(P<0.05)。非变异组ALT、AST、层粘连蛋白、透明质酸以及Ⅲ型前胶原肽水平明显低于变异组,清蛋白水平明显高于变异组,差异均有统计学意义(P<0.05)。pre-S基因缺失变异与ALT、AST、层粘连蛋白、透明质酸、Ⅲ型前胶原肽水平均呈正相关(P<0.05),与清蛋白水平呈负相关(P<0.05)。结论 pre-S基因缺失变异与HBV感染患者肝功能和肝纤维化指标明显相关。

乙型肝炎病毒PreS/S基因突变的研究进展

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)PreS/S基因突变十分常见,可由内因即病毒和宿主之间免疫反应导致,也可由免疫预防或者抗病毒治疗等外因引发。Pre-S区以缺失突变为主,S区以"a"抗原决定簇的点突变常见。此区域的突变可导致乙型肝炎病毒表面抗原(HBV surface antigen, HBsAg)和相关蛋白的合成、分泌障碍,具有重要的病理生理意义和临床影响。研究显示PreS/S基因突变与某些肝脏疾病发生及进展存在着明显的相关性;可使HBsAg的抗原性发生改变,因不被抗-HBs识别而导致HBsAg检测失败和已免疫者发生突破性HBV感染;是隐匿性乙型肝炎病毒感染(Occult HBV infection, OBI)的重要发生机制之一,而OBI是当前血液筛查的主要风险来源。目前,PreS/S基因突变研究仍缺乏更为广泛的长期监控数据,这是评估PreS/S基因突变实际影响的重要制约因素。

乙型肝炎病毒3’末端缺失的preS/S基因在转基因小鼠中的表达

从乙型肝炎病毒 ａｄｒ亚型的基因组 ＤＮＡ中分离 ３’末端缺失的ｐｒｅＳ／Ｓ基因的 ＤＮＡ片段，构建了由ＣＭＶ启动子控制的真核表达载体。采用受精卵显微注射方法，获得了基因组整合有３’末端缺失的ｐｒｅＳ／Ｓ基因的２个转基因小鼠品系。在不同的时间点采取血清进行了ＥＬＩＳＡ分析，发现在这２个小鼠品系中３’末端缺失的ｐｒｅＳ／Ｓ基因可被表达，而且呈稳定状态。此小鼠品系的建立，对于探讨乙型肝炎病毒３’末端缺失的ｐｒｅＳ／Ｓ基因的表达产物在体内的生物学作用及其与肝细胞内细胞癌基因的转录激活之间的关系有重要意义。

PCR检测HBV DNA与HBV血清标志物常见模式和Pre-S2相互关系研究

目的 探讨乙型肝炎病毒 (HBV)DNA与六种常见HBV血清免疫学标志物模式、前S2 蛋白抗原 (Pre -S2 )之间的相互关系及其临床检测意义。方法 采用PCR法对HBVDNA、ELISA法对HBV血清免疫学标志物、Pre -S2 同时进行检测。结果 1484例六种常见模式HBVDNA阳性率依次为 89 8% >5 5 6 % >2 1 8% >7 5 % >7 1% >6 8% ,即模式 (1) >(3) >(2 ) >(5 ) >(6 )>(4) ;而HBV血清免疫学标志阳性例数依次为 (2 ) >(1) >(3) >(5 ) >(4) >(6 )。 (2 )、(3)种模式HBVDNA与Pre S2阳性率比较P <0 0 1,其余 (1)、(4)～ (6 )种模式HBVDNA与Pre-S2 阳性检出率无显著性差异 (P >0 0 5 )。结论 HBV血清免疫学标志物、Pre -S2、HBVDNA的检测 ,三者缺一不可 ,ELISA法检测HBV血清免疫学标志物、Pre -S2 ,只是HBV的表型指标 ,提供HBV感染的间接证据。而PCR -HBVDNA的检测是HBV感染与否的直接证据。因此它们各自有其独特的临床检测意义。

乙型肝炎病毒preS2蛋白在转基因小鼠肝脏中的表达

目的 :分析乙型肝炎病毒 pre S2蛋白在 3′末端缺失的 pre S/ S基因转基因小鼠肝脏中的分布及其病理学作用。方法 :采用原核显微注射法将质粒 pc DNA3.1- pre S/ St注射入小鼠受精卵雄原核 ,制备转基因小鼠。PCR法在基因组水平筛选 3′末端缺失的 pre S/ S基因转基因小鼠首建者 (founder)及后代 ;免疫组织化学法在蛋白水平检测 pre S2蛋白在这些小鼠中的表达 ;H- E染色分析转基因小鼠肝组织的病理学变化。结果 :经原核显微注射法将目的片段注射入受精卵雄原核后 ,共出生 15只新生小鼠 ,其中存活 7只 ,经 PCR检测后获得 2只 founder转基因小鼠 ,命名为 C5 7- Tg N (pre S/ St) SMMU。免疫组织化学检测发现转基因小鼠肝细胞质中有 pre S 2蛋白表达 ,H- E染色发现转基因小鼠肝组织中央静脉周围有淋巴细胞聚集。将这 2只转基因小鼠与正常同系异性小鼠交配 ,进行传代培育 ,PCR法筛选阳性转基因小鼠 ,目前已传至 F2 代。 结论 :本研究成功建立了稳定遗传 3′末端缺失的 pre S/ S基因并表达 pre S2蛋白的转基因小鼠 C5 7- Tg N((pre S/ St) SMMU,它将是体内研究 3′末端缺失的 pre S/

大连地区无偿献血者隐匿性乙型肝炎病毒感染pre-S/S区基因分析

目的了解大连地区无偿献血者隐匿性肝炎乙型病毒感染(OBI)的情况和pre-S/S区基因的变异情况。方法对大连市血液中心2010年12月2日-2013年5月31日的无偿献血者血液标本进行常规ELISA(HBs Ag、抗-HCV、抗-HIV和抗-TP)和HIV/HBV/HCV联合NAT筛查,对于单独核酸检测反应性的献血者加以跟踪或回溯,结合乙型肝炎血清学标志物的试验、鉴别试验、病毒定量试验和半巢式PCR来确定OBI,同时对OBI的pre-S/S区基因序列与对照组(HBs Ag+序列,Genbank)做比对分析。结果共筛查158 232份血液标本,确定了其中的69份OBI,流行率为1∶2 293(69/158 232)。41例OBI获得pre-S/S区基因序列:B型6例、C型34例、D型1例;与对照组相比,OBI在S区的氨基酸序列的变异明显(PB=0.013;PC=0.003),主要变异位点为B型的V14G/A、Y161F/S、V168A、P217L和C型的E2G/A/V、T118R/K/A/M、P127T/L/H/S、E164D/G、L175S、S174N。结论大连地区献血者OBI在HBV基因组S区的氨基酸序列存在多个位点的变异,这些变异与OBI的产生存在某种关系,且这种关系受基因型的影响。

HBsAb阳性隐匿性乙型肝炎病毒感染者HBV PreS-S区基因突变研究

目的分析血清HBsAb阳性的隐匿性乙型肝炎病毒感染者HBV PreS-S区基因变异,初步探讨该特殊感染模式的发生机制。方法使用巢式聚合酶链反应(Nested PCR),对陕西省血液中心保存的38份HBsAb阳性隐匿性乙肝病毒感染(OBI)血清样本进行HBVPreS-S基因片段扩增并测序,确定基因型和血清型,并与对应基因型HBsAg阳性野毒株序列进行比对。结果 38份HBsAb阳性OBI血清样本中,11份成功扩增出目的基因,其中8份测序成功。C基因型5份,其中1份为血清型adw,4份为血清型adr;B基因型3份,全部为血清型adw。OBI毒株PreS-S区,PreS-S免疫反应区以及亲水区(MHR)氨基酸变异率均显著高于对应野毒株,差异有统计学意义(2.6%vs 0.8%,X^2=40.23,3.2%vs0.3%,X^2=52.13;3.6%vs 0.6%,X^2=10.25,均P<0.01),"α"抗原决定簇检测到I126T,Q129R,M133T,F134I,D1.44E,G145K突变。C基因型PreS-S区氨基酸变异率高于B基因型,差异有统计学意义(3.5%vs 1.2%,X^2=15.98,P<0.01);而其MHR,"α"抗原决定簇以及PreS-S免疫反应区氨基酸突变率虽均高于B基因型,但差异均无统计学意义(分别是4.7%vs 1.7%,X^2=2.96;3.6%vs 2.9%,X^2=0.25;4.1%vs 2.3%,X^2=3.59,均P>0.05)。结论 OBI毒株PreS-S区,尤其是PreS-S免疫反应区氨基酸发生较多变异,可能改变了病毒的免疫原性,造成免疫逃逸,从而导致HBsAbP阳性OBI发生。

重庆地区HBV流行株PreS/S、EnhⅡ/CP/PreC基因标准参照序列的初步建立

目的:建立重庆地区HBV流行株PreS/S、EnhII/CP/PreC基因标准参照序列,为HBV变异的研究奠定基础。方法:测定15例无症状携带者HBV的PreS/S、EnhII/CP/PreC序列,应用同源性分析和对齐比较等方法确定基因型/血清型,并拟定标准参照序列。结果:9株基因型B/血清型;adw2、3株基因型B/M清型ayw1、3株基因型C/血清型adrq+;建立的重庆地区HBV流行株(基因型B/血清型adw2)PreS/S、EnhII/CP/PreC标准参照序列与华东华南地区同亚型的标准参照序列比较分别有6个、1个核苷酸差异。结论:初步建立了重庆地区HBV流行株PreS/S、EnhIICP/PreC基因标准参照序列。

HBV Pre-S1蛋白及HBV-DNA含量检测在诊断乙肝病毒复制中的临床意义

目的:探讨乙肝患者不同血清学标志物模式(HBV-M)与乙肝病毒DNA含量及乙肝病毒前S1蛋白的关系,为预测乙型肝炎病毒的传染程度、预防、诊断及治疗提供实验室依据。方法:采用ELISA法对1385例携带不同血清学标志物的乙肝患者进行HBVPre-S1和乙肝5项指标检测,并用聚合酶链反应定量检测血清HBV-DNA含量。结果:不同HBV免疫模式中HBsAg、HBeAg和HBcAb同时阳性,其HBV-DNA和HBVPre-S1的检出率分别为90.7%和71.1%;HBsAg、HBeAb和HBcAb阳性组的检出率分别为35.8%和27.3%;其他不同血清学模式组也有不同的阳性率。结论:HBV-DNA、乙肝病毒5项标志和HBVPre-S1联合检测,对HBV感染早期诊断,了解病毒的复制情况,疗效观察和预后判断均具有重要意义。

HBV感染者血清中HBeAg，HBeAb与Pre—S1抗原的相关性研究

目的探讨HBV感染者HBeAg，HBeAb与Pre-S1抗原的关系及其临床价值。方法收集2012年1月～3月HBV感染者血清1080例，采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测HBsAg，HBsAb，HBeAg，HBeAb，HBcAb及Pre-S1抗原，应用SPSS17．0统计软件分析HBeAg，HBeAb与Pre-S1抗原的相关性。结果在1080例HBV感染者中，HBeAg阳性240例，HBeAg阴性840例，HBeAg阳性者和阴性者Pre-S1抗原阳性率分别为91．25％和70．12％，HBeAg阳性者Pre-S1抗原阳性率明显高于HBeAg阴性者，两者比较差异有统计学意义（x^2=44．24，P〈o．05）。在840例HBeAg阴性者中，HBeAb阳性者636例，HBeAb阴性者204例，HBeAb阳性者和阴性者Pre-S1抗原阳性率分别为65．72％和83．82％，HBeAb阳性者中Pre-S1抗原阳性率明显低于HBeAb阴性者，两者比较差异有统计学意义（x^2-24．15，P〈0．05）。结论血清HBeAg，HBeAb与Pre-S1抗原存在相关性。Pre-S1抗原阳性提示HBV复制活跃，传染性较强，Pre-S1抗原阴性可作为HBV被清除和感染趋于恢复，病情趋向好转的标志。

减少大型低温乙烯球罐预冷过程中VOC_(S)排放

对某石化企业乙烯罐区3000m^(3)低温乙烯球罐预冷过程的工艺操作进行了简要介绍,针对乙烯球罐需要预冷至-30℃以下才能接料投用的苛刻工艺条件及预冷操作的技术难题和安全环保风险,在理论分析可行的基础上,提出将预冷方式由“插底管进液”改为“顶部喷洒液滴”。实践证明,顶部喷洒液滴的预冷方式将球罐预冷时间由56h缩短至12h,减少了乙烯等挥发性有机物(VOC_(S))向火炬排放约30t,实现了碳减排和清洁生产目的。同时,也消除了因罐顶与罐底温差大导致球罐材质发生脆裂泄漏而引发的安全环保风险。

IL_2－HBVPre－S融合基因的克隆、表达及生物学活性初步鉴定

ＩＬ＿２－ＨＢＶＰｒｅ－Ｓ融合基因的克隆、表达及生物学活性初步鉴定杨晓峰，马文煜，姜绍谆，逮好英（第四军医大学微生物学教研室，西安７１００３２）ＩＬ２是最早发现的淋巴因子之一，它通过与激活的Ｔ淋巴细胞表面特异性受体的相互作用，在激活的Ｔ淋巴克隆中起着...

HBV不同模式感染者血清HBV-DNA与Pre-S_2相关性研究

目的 探讨HBV感染者不同模式血清Pre S2 与HBV DNA之间的关系。方法 应用聚合酶链反应技术 (PCR)和酶联免疫吸附法 (ELISA)对 742例HBV感染者血清 ,同时进行HBV DNA和Pre S2 检测。结果 HBeAg阳性血清中 ,HBV DNA和Pre S2 阳性率分别为 89.8%和 88 3 % ,均明显高于HBsAg阳性 (第二、三模式 )血清中HBV DNA(阳性率为 2 1 8%和 5 5 6 % )和Pre S2 (阳性率为 6 3 2 %和 81 2 % )的阳性率 (P <0 .0 1)。结论 HBeAg(+ )患者血清中 ,HBeAg ,HBV DNA和Pre S2 三者有较好的相关性 ,均可表示病毒复制活跃 ;HBsAg(+ )患者血清中 ,Pre S2 阳性率 (分别为 6 3 2 %和 81 2 % )明显高于HBV DNA阳性率 (2 1 8%和 5 5 6 % ) (P <0 .0 1) ,此时Pre S2 (+ )不能作为判断HBV复制活跃的确切指标。

HBV PreS2S/Fc融合基因真核表达载体的构建及表达

目的:构建含HBV PreS2S和Fc融合基因的真核表达载体pcDNA3 S2S/Fc并在真核细胞中进行表达. 方法:应用重叠延伸剪切技术(splicing by overlapping extension,简称SOE)经两次PCR获得嵌合基因片段S2S/ Fc,回收后克隆到pGEM-T Easy TA克隆载体,获得合适的酶切位点,再采用双粘端连接法转克隆入真核表达载体pcDNA3中,得到真核重组载体pcDNA3 S2S/Fc.然后用脂质体法转染SP2/0细胞. 结果:对重组载体进行了限制性酶切鉴定及测序分析,汪明连接正确;经间接免疫荧光捡测证实该重组载体能在真核细胞中表达插入的外源性基因编码的融合蛋白. 结论:真核表达载体pcDNA3 S2S/Fc的成功构建及在SP2/0 细胞中的有效表达,为进一步探讨HBV感染的特异性免疫治疗提供了实验依据.

乙型肝炎病毒表面抗原preS2+S基因在Pichia Pastoris酵母系统的分泌表达

拟获得adw2亚型乙型肝炎(乙肝)病毒表面抗原preS2+S基因在PichiaPastoris酵母分泌型表达系统(pPIC9K)的高效表达。实验首先将adw2亚型乙肝病毒表面抗原preS2+S基因重组到分泌型酵母表达载体(pPIC9K)形成表达质粒,电转化酵母细胞KM71,G418筛选多拷贝整合克隆,经甲醇诱导表达并用SDS-PAGE电泳及酶免疫法检测表达产物。经100个克隆筛选获得了表达量较高的表达菌株WC4。该菌株甲醇诱导后细胞上清10倍浓缩SDS-PAGE电泳检测显示,细胞上清中有特异蛋白条带,且第6天表达量最高,表达产物单体分子量为31kD左右。用美国雅培公司AUZYMEMONOCLONAL试剂盒估算表达量为2μg/100OD600细胞。上述结果表明,乙肝病毒表面抗原preS2+S基因在本系统中获得了分泌表达。同时检测了酵母细胞裂解液中特异蛋白质的表达,结果发现,自甲醇诱导后第一天即可检测到表达产物,而且除了第6天细胞外表达量高于细胞内外,其余各天的表达水平均表现为细胞内高于细胞外。以上结果提示,利用分泌型酵母表达系统表达乙肝病毒表面抗原在技术上可行,但表达产量偏低,一些蛋白滞留在细胞内未能分泌到培养基中。

急慢性乙肝患者血清preS1-Ag抗HBc-IgM检测的临床意义

目的观察急、慢性乙肝患者病变及治疗过程中Pre-S1Ag、抗HBc-IgM的变化并探讨其临床意义。方法应用酶联免疫法、荧光定量PCR技术及化学法对145例急、慢性乙肝患者病变及治疗过程中血清Pre-S1Ag、抗HBc-IgM、HBV-DNA及肝功能(总蛋白、白蛋白、总胆红素、直接/间接胆红素、丙氨酸氨基转移酶、总胆汁酸)等指标进行检测并观察其与预后的关系。结果Pre-S1Ag、抗HBc-IgM在急性乙型肝炎中检出率高达95.2%和97.6%,治疗后,两项指标均显著下降;肝功能完全恢复组Pre-S1Ag、抗HBc-IgM阳性率显著低于未恢复组(P<0.05);慢性活动性乙肝中两项指标均为83.3%且活动性乙肝组显著高于非活动性乙肝组;Pre-S1Ag、抗HBc-IgM与HBV-DNA阳性率高度相关(r1=0.98,r2=0.96,P<0.05)。结论检测Pre-S1Ag和抗HBc-IgM对急性乙肝的早期诊断、监测复制及预后评估及慢性乙肝的分类均具有较大价值。