应用蛋白组学方法筛选和鉴定乙型肝炎病毒PreS1结合蛋白

前S1蛋白(PreS1)在乙型肝炎病毒与宿主的相互作用中起至关重要的作用.为筛选乙型肝炎病毒PreS1结合蛋白,进一步探讨其在病毒感染过程中的作用,原核表达、纯化了PreS1-谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione-S-transferase,GST)融合蛋白,利用此蛋白与HepG2细胞裂解液进行Pull-down实验,其产物进行双向凝胶电泳分离.结果发现2个PreS1特异结合蛋白,经质谱鉴定为分子伴侣蛋白——葡萄糖调节蛋白78(GRP78)和葡萄糖调节蛋白75(GRP75).通过免疫共沉淀和Western印迹分析证实,PreS1与GRP75之间存在相互作用.实验结果表明,GRP75为新发现乙型肝炎病毒PreS1特异结合蛋白,其与PreS1结合后的生理功能以及在HBV感染过程中的作用值得深入研究.

酵母双杂交系统筛选HBV PreS1相互作用蛋白

目的利用Sos招募系统(SRS),构建含HBV PreS1基因的酵母双杂交诱饵载体,筛选人肝细胞与HBV PreS1蛋白相互作用的蛋白,进一步探讨HBV侵入肝细胞的机制。方法以HBV ayw亚型全长质粒PCP10为模板,PCR扩增HBV PreS1基因,克隆到酵母表达载体pSos中,构建诱饵质粒pSos-PreS1,将其转化cdc25酵母感受态细胞,提取酵母蛋白质进行Western blot分析,证实其在酵母细胞中的表达;将pSos-PreS1分别与pMyr Lamin C、pMyr SB共转化酵母,证实诱饵蛋白无自激活作用。将pSos-PreS1与人肝cDNA文库共转化cdc25酵母感受态细胞,通过营养及温度选择性培养筛选阳性菌落,扩增阳性菌落目的基因并测序。结果成功构建了HBV PreS1基因酵母双杂交诱饵载体pSos-PreS1,筛选得到5个准阳性克隆,序列分析表明其分别与人类钾通道调制因子1(KCMF1)、细胞色素C、VitD结合蛋白、人源去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)和人白蛋白具有高度同源性。结论利用SRS筛选出5个可能与HBV PreS1蛋白相互作用的蛋白,为进一步了解HBV侵入肝细胞的机制奠定了基础。

HBV preS1基因酵母表达载体的构建及表达

目的构建HBV preS1基因的酵母表达载体,探讨HBV preS1蛋白的功能。方法以HBVayw亚型全长质粒PCP10为模板,聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增HBV preS1基因,克隆到pGEM-T载体中命名为T-preS1,以NcoⅠ和MluⅠ双酶切T-preS1后回收与酵母表达载体pSos连接,对重组质粒进行序列测定后命名为pSos-preS1,经醋酸锂法将其转化酵母菌cdc25(a),提取酵母蛋白质进行Western免疫印迹分析。结果成功构建了HBV preS1基因的酵母表达载体,Western免疫印迹分析显示HBV preS1基因在酵母细胞中正确表达。结论pSos-preS1的构建为通过SOS招募系统(sos-recruit ment system,SRS)筛选与HBV preS1蛋白相互作用的蛋白和进一步探讨HBV preS1蛋白在HBV致病中的作用奠定了基础。

ASGPR与HBV preS1蛋白之间相互作用的验证

目的验证去唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoprotein receptor,ASGPR)与乙肝病毒前S1蛋白(HBV preS1蛋白)之间的相互作用,确认ASGPR作为乙肝病毒肝细胞膜受体在介导乙肝病毒感染的分子机制中的作用。方法分别用哺乳动物双杂交及体外免疫共沉淀技术验证ASGPR与HBV preS1蛋白之间的相互作用,操作方法参照试剂盒说明书进行。结果哺乳动物双杂交实验结果提示,ASGPR与HBV preS1蛋白在细胞环境中具有相互作用;免疫共沉淀实验结果提示,ASGPR与HBV preS1蛋白在非细胞环境中具有相互作用。结论 ASGPR可能是介导HBV入侵的肝细胞膜受体之一。

乙型肝炎病毒PreS1蛋白与初期多肽相关复合体α亚单位特异性结合的研究

目的探讨乙型肝炎病毒(HBV)PreS1蛋白与人类初期多肽相关复合体α亚单位(nascent-polypeptide-asso-ciated complex alpha polypeptide,NACA)之间的结合作用。方法采用交合实验验证PreS1蛋白和NACA在酵母细胞内的结合作用,利用离体结合实验证实二者在体外的结合作用,免疫共沉淀实验证实二者在哺乳动物细胞中的特异性结合。结果携带NACA基因的酵母同携带preS1基因的酵母交合后发生反应,LacZ活性检测菌落呈现蓝色,离体结合实验Western印迹中出现特异性结合活性反应条带,提示PreS1蛋白和NACA在体外存在直接相互作用,免疫共沉淀实验在13×103处出现蛋白条带,提示在哺乳动物细胞水平仍能检测到PreS1蛋白和NACA的特异结合。结论NACA与PreS1蛋白在酵母细胞和哺乳动物细胞中均存在特异性结合,推测NACA可能通过与PreS1蛋白的结合影响病毒黏附及反式激活等过程。

乙肝病毒表面抗原preS1与人肿瘤坏死因子α融合基因的表达

用ＰＣＲ法获得了ＨＢｓＡｇｐｒｅＳ１（１－６５）肽段基因，将该基因融合在肿瘤坏死因子（ｈＴＮＦα）之后，插入表达载体ＰＳＢ－９２中，使融合基因的５′端直接置于大肠肝菌ＰＬ启动子下游，采用３０℃培养，４２℃诱导，获得了ＴＮＦ与ｐｒｅＳ１（１－６５）融合蛋白的表达产物。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳显示表达产物为２５ｋＤ，约占细菌总蛋白的３５％。表达产物经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ验证，能分别特异地与ｈＴＮＦα抗体与ｐｒｅＳ１抗体结合，稀释复性后，该融合蛋白还具有ＴＮＦ的生理功能（对Ｌ９２９细胞的细胞毒活性）。经ＤＮＡ序列测定，ｐｒｅＳ１（１－６５）肽基因正确地融合在ｈＴＮＦα基因之后。该结果提供了一种制备ｐｒｅＳ１的新方法，为进一步开展治疗肝癌和乙肝的导向药物打下基础。

HBV PreS1蛋白酵母双杂交诱饵表达载体的构建及其毒性和自激活效应检测

目的利用Sos招募系统(SRS),构建含HBV PreS1基因的酵母双杂交诱饵质粒,并检测其表达产物对cdc25酵母细胞有无毒性作用及对报告基因有无激活作用。方法聚合酶链反应(PCR)扩增HBV PreS1基因的编码序列,定向克隆到酵母表达载体pSos中,构建诱饵重组质粒pSos-PreS1,经测序正确后其将转化酵母菌cdc25感受态细胞,检测其表达产物对酵母细胞有无毒性作用及对报告基因有无自激活作用。结果序列测定证实重组诱饵质粒pSos-PreS1构建成功。重组质粒转化入酵母细胞后,经检测其表达产物对cdc25酵母细胞无毒性作用,对报告基因亦无自激活作用。结论可以利用SRS来研究与HBV PreS1蛋白相互作用的蛋白,为进一步研究乙型肝炎病毒的致病机制奠定了基础。

hsTR55/TR75-preS1融合蛋白的表达与应用

目的简化测定hTNFα及其突变体的受体竞争结合活性的方法。方法将乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)前区(preS1)肽段(2～50)编码区,分别融合于hsTR55和hsTR75基因的C末端组成融合受体分子基因,并利用细小RNA病毒属脑炎心肌炎病毒EMCV的内核糖体进入位点(internalribosomeentrysite,IRES),构建了hsTR55/hsTR75以及它们与preS1组成的融合受体分子hsTR55hsTR75-preS1基因和新霉素抗性(neoR)基因的双顺反子表达载体,转染BHK-21细胞后用G-418持续筛选得到稳定表达目的蛋白的细胞株。结果RT-PCR及ELISA均证实,两种融合受体分子表达,并且表达上清对hTNFα的活性均具有一定的中和作用。在对表达上清进行ELISA定量后,我们还用Biosensor方法测定了这些可溶性受体分子与hTNFα的结合常数。结果表明,在融合preS1肽段前后,hTNFα与受体分子的解离常数变化不大。结论利用表达的两种融合受体分子,成功地建立了一种检测hTNFα及其突变体的受体竞争结合活性的ELISA法,并利用该法测定了野生型hTNFα及其4种突变体的受体竞争结合活性,所获结果与利用125I-hTNFα测定的结果具有相当的可比性。

乙型肝炎病毒PreS1蛋白研究进展

乙型肝炎病毒(HBV)属于嗜肝DNA病毒科,是多数肝脏疾病和肝癌的主要发病原因之一。慢性HBV感染是全球化的健康问题,肝癌是世界上最严重的恶性肿瘤之一,死亡率排在第三位,严重威胁人类健康。虽然我们对于这个具有高度肝脏特异性病毒的分子生物学研究的知识有所增加,但是病毒黏附和进入宿主细胞的机制仍是未知数。乙肝病毒PreS1蛋白位于HBV病毒颗粒表面,并在病毒的组装和感染中发挥重要的作用。为了阻止HBV入侵及抗病毒感染,目前一系列基于PreS1抗原肽的方法正在研究中,而这些有可能成为新的抗病毒治疗方法。

用Far-Western印迹技术筛选人肝组织中与乙肝病毒表面抗原PreS1相互作用的蛋白

目的:利用Far-Western印迹技术从正常人肝组织中筛选乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原PreS1结合蛋白,为阐明HBV的感染致病机理提供依据。方法:提取正常人肝组织细胞膜蛋白,双向电泳展示后转膜,对表达纯化获得的PreS1的重要片段与GST的融合蛋白PreS/1-48myr-GST进行Far-Western印迹实验,对筛选获得的蛋白点切胶,质谱鉴定。结果:对PreS/1-48myr-GST融合蛋白进行Far-Western-2D筛选,共获得22个蛋白点,经质谱鉴定获得15个候选相互作用蛋白,其中膜蛋白Ezrin可能在HBV感染致病过程中具有重要作用。结论:Ezrin蛋白能够与乙肝病毒表面抗原PreS1结合,其在HBV感染致病过程中的重要作用值得探索。

与乙型肝炎病毒preS1特异性结合的HepG2细胞膜受体样蛋白

本文对人肝癌细胞株ＨｅｐＧ２细胞株上与乙型肝炎病毒外周蛋白ｐｒｅＳ１特异性结合的膜受体样蛋白进行了研究。用麦芽糖结合蛋白－ｐｒｅＳ１－直链淀粉树脂亲和层析法，分离得到了与ｐｒｅＳ１特异性结合的ＨｅｐＧ２细胞的膜受体样蛋白质，并经抗ＭＢＰ－ｐｒｅＳ１的单克隆抗体Ｆ３５．２５结合Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ加以证实。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和ＰＡＧＥ结果显示，ＨｅｐＧ２细胞膜上存在四种不同的受体样蛋白：ＨＬ１，ＨＬ２，ＨＬ３和ＨＬ４，分子量分别为６８０００，６６０００，５１０００和４５０００．对ＨＬ１，ＨＬ２，ＨＬ３和ＨＬ４的氨基末端序列进行了分析。

抗preS1分子高效单克隆抗体的制备及其在血清LHBs检测中的应用

目的制备可用于血清LHBs检测的针对preS1高效单克隆抗体并进行初步临床应用研究。方法对乙肝preS1区段基因（B基因型,adr血清亚型）全长序列（1～119 aa）进行密码子偏嗜性改造后,克隆入质粒pET32a构建原核表达重组质粒并转化入大肠杆菌BL21（DE3）,采用离子交换、HIS亲和层析柱以及肠激酶（EK酶）酶切等方法建立preS1重组蛋白的纯化工艺,制备筛选单克隆抗体的筛选原;综合应用多种生物信息学分析软件预测LHBs preS1区段B细胞表位肽preS1（36～58 aa）,合成该肽段后与BSA交联,通过新型免疫程序制备单克隆抗体;建立以抗preS1高效单克隆抗体为基础的ELISA方法,并对临床血清LHBs进行检测分析。结果获得了高纯度的重组preS1蛋白,HPLC分析其纯度为98%,通过新型免疫程序制备的抗preS1单克隆抗体1-E6（IgG1）特异性好,对preS1（LHBs）的检出率（83.3%）高于其他同类抗体（P〈0.01）。结论获得高效特异的抗preS1单克隆抗体1-E6以及高纯度重组preS1蛋白免疫检测标准品。

乙型肝炎病毒表面抗原preS1在大肠杆菌中的表达与鉴定

本文报告利用pWR590质粒为载体,构建了含1ac启动子、β-半乳糖苷酶(1—590)基因、Xa因子的四肽识别位点和HBV preS1、preS2编码序列的表达质粒,并成功地在大肠杆菌中获得稳定表达。融合蛋白经Xa因子消化和高效液相层析,得到了preS1(1—91)纯肽。此肽特异性地与人肝细胞质膜结合,从而为肝细胞上存在preS1受体提供了直接的实验依据,也为分离和鉴定肝细胞上preS1受体打下了良好的基础。

噬菌体表面展示技术筛选乙型肝炎病毒前S1蛋白结合蛋白基因

目的 以乙型肝炎病毒 (HBV)前S1蛋白为靶蛋白 ,寻找其相应的结合蛋白。方法 应用T7cDNA文库噬菌体展示技术克隆与前S1蛋白具有结合作用的蛋白序列 ,命名为前S1结合蛋白 (PreS1BP)。将推断的氨基酸序列在蛋白质库中进行搜索 ,自GenBank中获得结合蛋白的cDNA和基因组的全长序列。结果 初步确定PreS1BP即为神经胶质瘤抑制基因区候选基因 2 (GLTSCR2 ) ,cDNA长为14 36核苷酸 ,基因位于第 19号染色体长臂 13.3区 (19q13 3) ,长度 114 4 5碱基对 (bp) ,位于 19号染色体 10 4 0 3483～10 4 14 989,PreS1BP基因含有 13个外显子 ,具有 12个内含子。结论 应用T7cDNA文库噬菌体展示技术和生物信息学方法获得了HBVPreS1BP基因。

基于乙型肝炎病毒核心蛋白的颗粒性肽展示载体的构建

为提高HBVpreS1aa21 47的免疫原性,将1～6拷贝的preS1(21 47)片段以串联方式插入HBcAg的aa78和aa82之间,在大肠杆菌中进行表达和纯化.携带1～3拷贝的重组抗原CI、CII和CIII的表达产量约占菌体总蛋白的20%,而携带4～6拷贝的重组抗原则未见明显表达.电镜检测显示重组抗原CI、CII和CIII可以形成形态与HBcAg类似的类病毒颗粒,颗粒直径在30～34nm之间.ELISA分析显示这3种VLP抗原具有很强的preS1抗原的免疫反应性,而对HBc单克隆抗体则基本失去反应性.提示外源多肽pre(21 47)可被有效地递呈至类HBc颗粒的表面,且外源多肽的插入使HBc主要的免疫优势表位遭到了破坏.这些证据表明利用HBcAg的专一性呈递能力来构建多价抗原可作为免疫原设计时的一种策略.

前S1蛋白在乙型肝炎的诊断及预后判断中的临床价值

目的探讨前S1蛋白(PreS1)在乙型肝炎诊断及其预后判断中的临床意义。方法收集乙型肝炎患者血清共197例,检测其HBV-DNA,PreS1,HBV血清标志物,ALT和AST。结果在携带不同HBV血清标志物的各组患者中,PreS1与HBV-DNA的检出率较一致。在不同临床类型乙型肝炎患者中,PreS1与HBV-DNA的检出率高度符合,PreS1的阳性率较HBeAg高。以HBV-DNA定量>5×102拷贝/ml为阳性诊断标准,PreS1与HBV-DNA的检出率无显著性差异(P>0.05);HBeAg与HBV-DNA的检出率有显著性差异(P<0.001)。142例HBeAg阴性者中HBV-DNA与PreS1的检出率分别为57.7%,56.3%,两者无显著性差异(P>0.05),说明部分患者仍存在着病毒复制。PreS1阳性与阴性患者的转氨酶水平有显著性差异(P<0.05),说明PreS1阳性患者较阴性患者肝组织损伤严重。结论PreS1较HBeAg更敏感地反映HBV的复制情况,特别对HBV病毒是否发生基因变异是主要的观察指标;在急性乙型肝炎患者中,PreS1阴转越早,预后越好。

乙肝病毒DNA和前S1抗原及其标记物三者相关性分析

目的探讨乙肝病毒前S1抗原（PreS1）与乙肝病毒DNA（HBV DNA）、乙肝病毒标志物（HBVM）之间的相关性，为拉米夫定（Lamivudine）治疗提供新的监测指标。方法收集慢性乙型病毒性肝炎患者500例，其中HBV DNA阳性400例（拷贝数〉500／ml），按HBV—DNA含量由低到高分8组；其余为HBV DNA阴性对照100例。同步以酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测PreS1；以电化学免疫发光法检测乙肝病毒e抗原（HBeAg）、乙肝病毒e抗体（HBeAb）、乙肝病毒表面抗原（HBsAg）；以荧光定量PCR法检测HBV DNA（以HBV DNA拷贝数〉500／ml为阳性）。结果（1）在HBVDNA拷贝数500—1×10^6／ml之间，PreS1的阳性率比HBeAg高（P〈0．05）；在HBV DNA拷贝数1×10%6／ml以上，二者阳性率无显著性差异（P〉0．05）；（2）PreS1的灵敏度为90％（360／400），高于HBeAg的68．5％（274／400）（P〈0．05）：PreS1的阴性预示值为55．6％（50／90），高于HBeAg的43．2％（96／222）（P〈0．05）；PreS1的检测有效率为82．0％（410／500），高于HBeAg的64．8％（324／500）（P〈0．05）。（3）在HBV DNA拷贝数500-1×10^4／ml之间，HBsAg的阳性率比PreS1高（P〈0．05），在HBV DNA拷贝数1×10^4／ml以上，HBsAg的阳性率与PreS1的阳性率无显著性差异（P〉0．05）。在HBV DNA拷贝数500-1×10^6／ml之间，HBeAb有较高的阳性率。结论PreS1与HBV DNA具有较好的相关性，其检测灵敏度和阴性预示值、检测有效率都优于HBeAg检测。PreS1可作为拉米夫定等抗病毒药物疗效观脊指标之一。HBeAg阴性、HBeAb阳性不是传染性消失的可靠指标。

乙型肝炎病毒前-S1蛋白反式激活蛋白3基因的克隆化研究

目的 应用抑制性消减杂交技术 (SSH)及生物信息学技术 (bioinformatics)筛选并克隆乙型肝炎病毒 (HBV)前 S1蛋白(Pre S1)反式激活新型靶基因 ,进一步阐明HBV感染相关疾病的发病机制。方法 以HBV前 S1蛋白表达质粒pcDNA3 .1(-) PreS1转染HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3 .1(-)为平行对照 ,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析。并应用分子生物学技术 ,结合生物信息学技术 ,克隆HBV前 S1反式激活作用的新的靶基因。结果 对于所获基因片段序列分析表明 ,其中之一为新型基因片段。从HepG2细胞提取总RNA ,以逆转录多聚酶链反应 (RT PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列 ,并测序证实 ,因其可以被前 S1蛋白反式激活 ,故命名为前 S1反式激活蛋白 3 (PS1TP3 ) ,已在GenBank中注册 ,注册号 :AY44 62 74。PS1TP3基因的编码序列全长为 1173个核苷酸 (nt) ,编码产物由 3 90个氨基酸残基 (aa)组成。结论 HBV前 S1蛋白在HBV进入宿主细胞的过程中起着重要的作用 ,最近的研究表明前 S1蛋白还具有反式激活的作用 ,上调宿主细胞某些基因的表达 ,从而改变宿主正常的免疫应答水平 ,引起病变。HBV前 S1反式激活新靶基因的发现 ,为进一步研究HBV前

乙型肝炎病毒表面抗原S和前S1融合基因转基因细胞系的建立与细胞性质的研究

构建了 pCHBSSIG质粒 ,其特点是CMV立即早期启动子调控乙型肝炎 (乙肝 )表面抗原S +前S1融合基因在前 ,SV40早期启动子调控GS扩增基因在后 ,此质粒转化到CHO dhfr-细胞中 ,经克隆加MSX及MTX筛选、扩增 ,建立了 7个高效表达乙肝表面抗原S及前S1融合蛋白细胞系GdSS1,并检测了其中GdSS1 18细胞系的生物学特性 ,结果表明 :未发现微生物污染 ,无致瘤性 ,遗传稳定 ,电镜下可观察到 2 2nm的颗粒 ,纯化后的蛋白在SDS PAGE及Westernblot中显示出特异性的 2 7kD、30kD乙肝表面抗原S和前S1的融合蛋白带。主蛋白的反向被动血凝(RPHA)滴度为 1∶2 5 6～ 1∶5 12 ,前S1蛋白的ELISA滴度为 1∶12 8。

HBV前S1蛋白与HepG2细胞膜蛋白结合位点鉴定

为鉴定HepG2细胞膜蛋白识别HBV包膜蛋白preS1区的位点。通过删除突变的方法构建preS1的不同区域片段与GST融合的重组表达质粒,将表达质粒转入E.coli BL21菌株中原核表达,以生物素标记HepG2细胞膜蛋白,pull down试验分析HepG2细胞膜蛋白识别preS1的位点。结果表明,21～33位氨基酸是HepG2细胞膜蛋白识别preS1的主要位点。通过对HepG2细胞膜蛋白与preS1结合的位点的分析,为进一步研究preS1在HBV早期感染中的作用和HBV包膜蛋白受体打下基础。