乙型肝炎病毒(adr亚型)preS2-S基因转基因小鼠的建立

目的 :建立可表达乙型肝炎病毒 (adr亚型 )包膜中蛋白的转基因小鼠品系。 方法 :通过原核显微注射法制备带有乙型肝炎病毒 (adr亚型 ) pre S2 - S基因的转基因小鼠。应用 PCR方法筛选乙型肝炎病毒 pre S2 - S基因转基因首建者 (founder)小鼠 ,再以免疫组织化学法分析乙型肝炎病毒蛋白在这些小鼠中的表达特性 ,PCR和免疫组化均阳性的转基因小鼠与正常同系异性小鼠交配用于传代培育 ,并用 PCR法检测其子代小鼠。结果 :共注射受精卵 6 9枚。选取存活受精卵 5 8枚分别植入 4只假孕小鼠 ,产仔并存活 2 3只。经尾组织 DNA PCR筛选得到 5只整合 pre S2 - S基因的 founder小鼠 ,免疫组织化学法发现其中3只小鼠的肝脏中表达 HBs Ag,进而对其中表达较强的阳性鼠进行保种。结论 :所建立的乙型肝炎病毒 (adr亚型 ) pre S2 - S基因转基因小鼠品系具有表达乙肝病毒中蛋白的生物学特性 。

乙型肝炎病毒表面抗原preS2+S基因在Pichia Pastoris酵母系统的分泌表达

拟获得adw2亚型乙型肝炎(乙肝)病毒表面抗原preS2+S基因在PichiaPastoris酵母分泌型表达系统(pPIC9K)的高效表达。实验首先将adw2亚型乙肝病毒表面抗原preS2+S基因重组到分泌型酵母表达载体(pPIC9K)形成表达质粒,电转化酵母细胞KM71,G418筛选多拷贝整合克隆,经甲醇诱导表达并用SDS-PAGE电泳及酶免疫法检测表达产物。经100个克隆筛选获得了表达量较高的表达菌株WC4。该菌株甲醇诱导后细胞上清10倍浓缩SDS-PAGE电泳检测显示,细胞上清中有特异蛋白条带,且第6天表达量最高,表达产物单体分子量为31kD左右。用美国雅培公司AUZYMEMONOCLONAL试剂盒估算表达量为2μg/100OD600细胞。上述结果表明,乙肝病毒表面抗原preS2+S基因在本系统中获得了分泌表达。同时检测了酵母细胞裂解液中特异蛋白质的表达,结果发现,自甲醇诱导后第一天即可检测到表达产物,而且除了第6天细胞外表达量高于细胞内外,其余各天的表达水平均表现为细胞内高于细胞外。以上结果提示,利用分泌型酵母表达系统表达乙肝病毒表面抗原在技术上可行,但表达产量偏低,一些蛋白滞留在细胞内未能分泌到培养基中。

HBVpreS2-S基因诱发的体液免疫引起乙肝转基因小鼠肝组织损伤

目的 :探讨乙型肝炎病毒 (HBV) pre S2 - S基因诱发的体液免疫在乙型肝炎发病机制中的作用。 方法 :用含 HBVpre S2 - S基因的质粒 pc DNA3- S2 - S经胫骨前肌肌肉注射免疫正常 BAL B/ c小鼠获得抗血清 ,将抗血清经尾静脉注射到转基因小鼠 BAL B/ c- Tg N(pre S2 - S/ ayw)体内 ,不同时间点静脉采血检测小鼠血清 HBs Ag、抗 HBs抗体、前 S2抗原、前 S2抗体、转氨酶、尿素氮和肌酐的变化 ,并处死动物检查肝、脾、肾、肠、肺和肌肉组织的病理学改变。 结果 :DNA免疫正常小鼠后 8～14周 ,抗 HBs抗体的浓度维持在 130～ 14 0 m IU/ ml;免疫后小鼠抗血清转移到转基因小鼠 BAL B/ c- Tg N(pre S2 - S/ ayw)后 2、4、7和 14 d,小鼠血清中未检测到 HBs Ag和前 S2抗原 ,抗 HBs抗体持续阳性 ,前 S2抗体 14 d时转阴 ;AL T2、4 d升高 ,7d恢复到正常 ;AST14 d内始终高于正常值 ,4 d时达高峰 ;尿素氮异常 ,γ- GT与肌酐正常。转基因小鼠肝脏出现急性乙型肝炎的改变 ,初期 (2 d、4 d)血窦内和汇管区有淋巴细胞浸润 ,4 d肝细胞开始肿胀 ;中期 (7d)全小叶出现肝细胞气球样变 ,肝小叶内出现肝细胞点灶性坏死伴单个核细胞浸润 ,汇管区轻度单个核细胞的浸润 ;后期 (14 d)时肝细胞肿胀明显减轻 。

T载体克隆乙肝病毒preS2+S基因的实验研究

将商品化真核表达载体pcDNA3改造成T载体pcDNA3－T，并运用pcDNA3－T直接克隆了由PCR扩增的adw2亚型乙肝病毒preS2与S基因。结果：pcDNA3－T与PCR产物的重组率高达70％。提示：该方法具有简便，省时等特点。

多角体蛋白基因核苷酸序列对HBsAg(PreS2+S)在家蚕中表达的作用

应用PCR突变的方法 ,在乙肝病毒表面抗原 (HBsAg)前S2序列的 5’端融合了BmNPV多角体蛋白基因5’端的 12个碱基 ,获得了融合乙肝表面抗原中蛋白基因 (HBMp) ;通过同源重组将其插入到BmNPV基因组多角体启动子后 ,构建了重组杆状病毒BmPAK HBMp。用重组病毒BmPAK HBMp和BmPAK HBM(带有非融合乙肝表面抗原中蛋白基因 )感染家蚕细胞及蛹 ,对两种病毒的表达产物用ELISA进行了跟踪检测 ,结果表明融合蛋白比非融合蛋白HBsAg活性提高了 6 0 %～ 80 % ,作为HBsAg构成部分的PreS2抗原性提高了 8～ 10倍 ;并且HBsAg和PreS2 Ag表达的时相曲线不同 ,PreS2 Ag的表达量比HBsAg早 1～ 2d达到最大值。ELISA检测和Westernblotting分析表明 ,多角体基因序列的存在更有利于中蛋白全基因 (PreS2 +S)的表达。

乙型肝炎病毒PreS_2S基因在毕赤酵母中表达的研究

构建重组质粒PHIL-D2/PreS2S以研究乙肝病毒PreS2(120-146)S基因编码蛋白在毕赤酵母中的表达。通过PCR扩增获得PreS2S片段,插入含AOX1启动子的Pichia Pastoris表达载体PHIL-D2中,构建重组表达质粒PHIL-D2/PreS2S,转化酵母宿主菌GS115。挑取阳性克隆摇床培养,甲醇诱导表达。通过ELISA、RPHA鉴定表达产物。成功构建了PHIL-D2/PreS2S真核表达载体,经过序列分析,插入的基因为在中国流行的adr亚型。在毕赤酵母中重组载体表达了S蛋白,S蛋白的表达量为34.9 mg/L,PreS2抗原检测为强阳性。利用毕赤酵母表达系统能够有效地表达乙型肝炎病毒的PreS2S蛋白,PreS2S蛋白具有良好的生物学活性。