苹果黑星病菌的分子检测

【目的】建立苹果黑星病菌(Venturia inaequalis(Cooke)Wint)的分子检测方法,以提高检测精确度,缩短检测时间。【方法】根据苹果黑星病菌与其他苹果病原真菌核糖体基因转录间隔区(Internal transcribed spacer,ITS)序列间的差异,设计了1对特异性引物320A/320B,用于苹果黑星病菌的分子检测,对特异性引物扩增条件进行了优化,并验证和检验了引物的特异性和灵敏度。【结果】特异性引物的扩增条带约为320bp,优化的反应体系为:2μL MgCl2(25mmol/L),2.5μL 10×buffer,3μL dNTP(2.5mmol/L),1.2 μL引物320A/320B(10μmol/L),0.5μL聚合酶(5U/μL),1μL模版DNA(30ng/μL),加ddH2O至总体积25μL;反应程序为:94℃3min;94℃变性30s,60℃退火30s,72℃延伸30s,35个循环;72℃延伸10min。利用该对特异性引物对包括苹果黑星病菌在内的26个苹果病原菌菌株基因组DNA进行的PCR扩增表明,只有苹果黑星病菌能扩增到1条约320bp的特异性条带,其他菌株及阴性对照的扩增产物均未检测到特异性条带。对接种苹果黑星病菌的苹果组织的检测表明,该对引物能特异性地检测到苹果黑星病菌的存在,其对苹果黑星病菌基因组DNA检测的灵敏度为100fp/μL。【结论】利用设计的特异性引物320A/320B,参考正交试验优化的体系和程序,结合简单的SDS法提取苹果黑星病菌基因组DNA,在1个工作日内即可完成对该病原菌的分子检测。

用于聚合酶链式反应(PCR)引物设计的计算机程序

本文报道了两个用于PCR引物设计的计算机程序PCRDESN和PCRDESNA。PCRDESN程序主要从以下4个方面评价用户自己设计的一对引物的质量:(1)引物内的碱基反向重复或发夹结构,(2)两个引物之间的碱基互补配对,(3)两个引物之间的同源性,(4)引物的碱基组成及特点和T_m值计算。通过用多例文献发表的及本院有关实验室提供的引物对序列的验证,确定了程序的运算参数,证明该程序能较好地检验引物对的质量和解释某些PCR实验失败的原因。PCRDESNA程序采用逐级优化的方法和比PCRDESN所选用的更严紧的引物选择参数对用户提供的核酸序列进行快速检索,以确定所有可能的和合适的引物对。

坦克炮弹药共用底火装定能量双向隔离系统设计方法

针对坦克炮、自行火炮信息化弹药膛内实时装定问题,采用共用底火的装定系统对入膛后的弹药进行实时装定。为了解决共用底火装定系统中存在击发能量流与装定能量流对装定回路和击发回路产生影响的问题,建立了能量流双向隔离系统边界条件和隔离系统函数,并通过对函数的参数取值设计了针对特定击发能量类型的隔离系统。试验结果表明,采用该方法得到的隔离系统能够有效地隔离装定能量流和击发能量流,且其对击发能量流的损耗很小。

贵州HCV感染株基因分型研究

为了解本地区ＨＣＶ感染株的基因型及现有分型方法的适用性，从贵州２０６例慢性肝炎和血液病患者中筛出３５份抗－ＨＣＶ阳性血清，用逆转录套式聚合酶链反应作ＨＣＶＲＮＡ检测。３０份ＨＣＶＲＮＡ阳性血清用３种分型方法（核心区特异引物ＰＣＲ，非结构５区特异探针核酸杂交，５′末端非编码区限制性长度多态性分析）进行ＨＣＶ基因分型。结果３份血清为ＨＣＶ２ａ感染，２７份为ＨＣＶ１ｂ感染。对８份ＨＣＶ１ｂ、１份ＨＣＶ２ａ血清的ＰＣＲ扩增产物直接测序，核酸序列分型结果与原型别一致。表明ＨＣＶ１ｂ是贵州地区ＨＣＶ感染株的主要基因型，ＨＣＶ２ａ感染并不常见。以ＨＣＶ基因组不同区域为基础的各方法分型结果间有很好的相符性。

一种多元聚合酶链反应的引物集选择算法

多元聚合酶链反应(multiplex PCR,MP-PCR)是一种运用多对引物同时扩增多条DNA序列或一条DNA序列上多个区域的生物学实验方法.引物集设计对于实验的成功至关重要.由于引物合成是实验成本的主要来源,且引物需要满足许多约束条件,因此设计满足多约束条件的最小引物集是保证实验成功、降低实验成本的有效手段.首先给出多约束最小引物集选择问题(minimum primer set selection problem with multiple constraints,MPSSPMC)的数学模型,通过引入新颖的遗传算子,提出一种求解该问题的单亲遗传算法MG-PGA.实验结果表明MG-PGA在满足多约束条件下能获得较小的引物集,为MP-PCR引物设计提供了一种有效的解决方法.

分子标记鉴定法鉴别3种麻类韧皮纤维的研究

文中开发了一种利用特异性PCR(聚合酶链式反应)引物组进行分子标记的辅助方法,以实现对汉麻、苎麻和亚麻的韧皮纤维进行分子生物学鉴定。采用收集的汉麻、苎麻、亚麻3种麻类植物的9个亚种提取基因组DNA并进行简化基因组测序,通过建库与筛选得到能用于鉴定3种麻类韧皮纤维种类的3组特异性PCR引物组。结果表明:通过PCR扩增试验验证证明设计的引物组能实现对汉麻、苎麻和亚麻韧皮纤维种类的定性鉴定;使用植物基因组DNA提取试剂盒法可获得高质量的麻类韧皮纤维DNA样品用于后续的分子标记鉴定方法。

共线式底火装定电缆对信号传输的影响研究

针对引信共线式底火装定过程中装定信号受电缆影响的问题,利用圆柱形电容器和平板电容器计算模型,推导了不平行电缆间以及电缆与坦克车金属板间分布电容的表达式;利用Orcad对共线式底火装定系统等效电路模型进行仿真分析,最后通过实验对上述结论进行验证;研究结果表明:影响装定信号传输的两个主要因素是电缆长度和工作环境;相较于空气中,50 m电缆在水中的传输信号波形的下降沿变化时间增加了约25μs,对装定信号传输速率影响巨大。

基于种特异性COI标记的西花蓟马温室品系和羽扇豆品系一步双重快速鉴定技术

【背景】西花蓟马(Frankliniella occidentalis)是世界性农业和园艺作物害虫,也是我国重要的对外对内检疫对象。西花蓟马具有两个品系,即温室品系(greenhouse race,GR)和羽扇豆品系(lupin race,LR),二者在寄主范围、抗药性、生存环境等方面均具有明显差异,但外部形态相似,无法准确鉴别。【目的】以西花蓟马温室品系和羽扇豆品系为靶标,以田间常见的其他14种蓟马为参照,采用基于线粒体DNA细胞色素C氧化酶亚基I(mitochondrial DNA cytochrome c oxidase subunit I,mtDNA COI)基因的种特异性(species-specific COI,SS-COI)PCR法,研究一步双重品系快速检测技术。【方法】采用mtDNA COI基因通用引物获得西花蓟马温室品系和羽扇豆品系以及其他常见蓟马的COI序列,根据测序结果以及数据库已公开数据,设计筛选获得可同时扩增两个品系的特异性组合引物(TF6/GR32/LR12),其中TF6为品系通用上游引物,GR32为温室品系特异性下游引物,LR12为羽扇豆品系特异性下游引物,其扩增片段大小分别为温室品系362 bp、羽扇豆品系541 bp;对组合引物比例和退火温度进行优化;同时,对组合引物的种/品系特异性和灵敏性/检测阈值进行检验。【结果】当组合引物TF6/GR32/LR12比例为1.0/0.2/0.8、退火温度为44℃时,扩增效果最好。种/品系特异性检测结果证实,该检测技术仅对西花蓟马温室品系和羽扇豆品系具有扩增能力,对田间常见的其他14种蓟马包括花蓟马(Frankliniella intonsa)、禾花蓟马(Frankliniella tenuicornis)、黄胸蓟马(Thrips hawaiiensis)、大蓟马(Thrips major)、棕榈蓟马(Thrips palmi)、烟蓟马(Thrips tabaci)、普通大蓟马(Megalurothrips usitatus)、豆喙蓟马(Mycterothrips glycines)、草木樨近绢蓟马(Sussericothrips melilotus)、蔗腹齿蓟马(Fulmekiola serrata)、稻简管蓟马(Haplothrips aculeatus)、榕端宽管蓟马(Mesothrips jordani)、榕母管蓟马(Gynaikothrips ficorum)和横纹蓟马(Aeolothrips fasciatus)等不具有扩增能力。灵敏性检测结果显示,该组合引物不仅对单一品系或混合品系的成虫具有良好的扩增效果,对单粒卵、1龄和2龄幼虫以及预蛹和蛹均具有同样的扩增效能;对温室品系的最低检测阈值为35.90 pg·μL^-1,相当于1/10 240头雌成虫,对羽扇豆品系的最低检测阈值为146.95 pg·μL^-1,相当于1/2 560头雌成虫;同时,对来自不同地域的同一品系不同单倍型的成虫亦具有良好的扩增效能。【结论】建立的技术体系完全可以用于西花蓟马品系的快速鉴定及检疫监管,对有效阻截其进一步传播扩散及靶向防控措施制定意义重大。

以主要流行EV71 VP1基因高度保守区为靶点的TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

在我国,肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)C4型是引起手足口病的主要流行基因型。为建立EV71C4型TaqMan荧光定量PCR检测方法,在C4型EV71VP1基因的高保守区,设计合成引物和TaqMan探针,将包含此目的区段的基因片段克隆到pcDNA3.1载体中,通过体外转录获得标准品,并以梯度稀释的标准品为模板建立工作曲线,进而在优化反应条件的基础上建立TaqMan荧光实时定量PCR检测方法。实验中,所设计引物、探针的高度保守性保证了C4型EV71的高效扩增。经反应条件优化,引物和探针的最佳工作浓度分别为300 nmol/L和200 nmol/L,在1×10~301×10~3拷贝数检测范围内具有良好的线性关系(R^2=1),灵敏度可达到10~2 copies/μL。通过对该方法进行检验发现,批间和组间重复实验的变异系数均小于0.5%,且该方法对柯萨奇A16(coxsackievirus A16,CA16)柯萨奇B1(coxsackievirus B1,CB1)人轮状病毒(human rotavirus,HRV)单纯疱疹病毒2型(herpes Simplex virus type 2,HSV-2)均无交叉反应,对6份EV71阳性样本检出率为100%。以上数据表明,文中建立的TaqMan荧光定量PCR方法可为我国主要流行C4型EV71感染的快速诊断及疾病监控提供有效途径。

乌贼DNA条形码的筛选与验证

目的筛选适于鉴定乌贼的DNA条形码,建立鉴定舟山常见乌贼种类的DNA条形码技术体系。方法用聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)对现有5组DNA条形码引物组合进行了筛选,设计一对新的DNA条形码引物以供筛选备用。结果现有引物与部分乌贼的DNA模板存在错配而缺乏通用性,在部分乌贼DNA的扩增受阻。本实验设计的12S rRNA基因引物可以特异性扩增乌贼的DNA,提高了乌贼鉴定的准确度。结论本研究设计的12S rRNA基因引物可以作为现有乌贼DNA条形码鉴定的补充。

4组鱼类DNA条形码引物的筛选与优化

目的通过对DNA条形码氧化酶亚基I基因(cytochrome oxidase subunit I,COI)的4组常用引物进行比较筛选,选择适于舟山鱼类鉴定的最佳引物。方法以舟山主产大黄鱼、小黄鱼、带鱼和乌贼样品DNA为模板,对4组常用DNA条形码引物进行PCR体系优化。通过比较PCR产物量、特异性、灵敏度和测序成功率,综合分析筛选最佳引物组。结果 4组引物均能扩增大黄鱼、小黄鱼和带鱼的DNA,对于乌贼DNA的扩增具有明显差异。COI优化引物具有易于扩增、测序简单等优势,更适于作为海产品鉴定的DNA条形码引物。结论本研究为舟山海产品的市场监管和实验室大量样品检测提供了技术参考。

基层底涂处理对喷涂速凝橡胶沥青防水涂料施工的影响研究

分别采用水性环氧底涂、高渗透环氧底涂、油性聚氨酯底涂3种体系对混凝土基层进行处理后,在其硬化表面进行喷涂速凝橡胶沥青防水涂料的施工,通过拉拔试验数据、相关试验现象和实际工程应用效果,证明基层的底涂处理能够起到强化基层密实度、封闭基层毛细孔径的作用,进而提高喷涂速凝橡胶沥青防水涂膜与基层的粘结力,解决涂膜起泡、开裂以及翘边等问题。