文山高峰牛朊蛋白基因(PRNP)23 bp和12 bp插入/缺失多态性分析研究

为探讨文山高峰牛朊蛋白基因(prion protein gene,PRNP)启动子区23 bp和第一内含子区12 bp插入/缺失多态性特征,本研究采用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)和琼脂糖凝胶电泳的方法对文山高峰牛PRNP基因23 bp和12 bp位点进行基因分型,得出其多态性数据;通过与文献所报道的牛PRNP数据进行比较分析,得出文山高峰牛对疯牛病抗病性的强弱。结果表明:文山牛PRNP基因启动子区23 bp等位基因频率以缺失型为主(0.654);第一内含子区12 bp等位基因频率分别为插入型0.913,缺失型0.087;缺失型单倍型频率极低(0.082);与德国、英国以及瑞士3个国家所报道的患BSE病牛和健康牛相比较存在显著差异(P<0.05),12 bp等位基因插入/缺失频率与水牛不存在显著差异(P>0.05)。由此可见,较高的12 bp插入型等位基因和极低的缺失型单倍(23 bp插入-12 bp缺失)频率,使得文山高峰牛对BSE疾病具有较好抗病力,通过抗病育种分析能够有效预防疯牛病的发生;对中国地方牛种质资源进行相关抗病性评估,有利于为牛的抗病分子选育提供数据支撑。

绵羊PRNP遗传多样性与抗病育种研究进展

朊蛋白(Prionprotein,PrP)是近年来被确认的引起人畜共患病的新型病原体,也是目前证明的具有自我复制和传播能力的蛋白质。PrP在多种动物体内表达并具有重要生理作用,其空间结构改变被认为是可传播性海绵状脑病(Transmissible spongiform encephalopathies,TSEs)的根源,研究发现朊蛋白编码基因(PRNP)遗传多样性与绵羊对瘙痒病的抗病性具有显著相关性。文章主要介绍了绵羊PRNP遗传多样性与痒病抗病性的关系以及PRNP遗传多样性对繁殖力和其他主要生产性能的影响等方面的研究成果,旨在为绵羊抗病育种研究提供理论参考。

牛羊朊蛋白基因(PRNP)多态性与抗病性的研究进展

朊蛋白(PRNP)是近年来造成人和部分哺乳动物传染性海绵状脑病(TSE)的主要根源,该基因的多态性显著影响了人和动物对TSE的易感性或抗病性。本文分析了朊蛋白基因及其编码蛋白的结构与功能;简要介绍了绵羊基因编码区突变与致病性的关系;系统分析了牛科动物启动子区域内23 bp的插入/缺失、第一内含子区域内12 bp的插入/缺失及其与疯牛病(BSE)抗病性的作用机制;全面总结了全球已经报道的牛科动物12和23 bp插入/缺失的等位基因与单倍体频率,评价了其发病的可能性。该研究将为牛的分子育种提供指导。

PI3K/AKT/FoxO信号通路在胰岛素类似生长因子1调节神经细胞PRNP基因表达中的作用

目的探讨磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/叉头状转录因子O亚家族蛋白(Fox O)信号通路在胰岛素类似生长因子1(IGF-1)调节神经细胞PC12细胞株PRNP基因表达中发挥的作用。方法将对数生长期的PC12细胞分为IGF-1组、实验1组和实验2组和对照组。IGF-1组加入终浓度80 ng/m L的IGF-1;实验1、2组先加入25、50μmol/L的PI3K/AKT/Fox O信号通路抑制剂LY294002,37℃培养30 min后再滴入80 ng/m L的IGF-1。对照组不加药物。继续培养24 h。采用实时荧光定量PCR法测算各组PC12细胞PRNP mRNA相对表达量,采用Western blotting法测算各组PC12细胞AKT、磷酸化AKT(p AKT)、Fox O3a和磷酸化Fox O3a(p Fox O3a)蛋白相对表达量。结果 IGF-1组PC12细胞PRNP mRNA及p AKT、p Fox O3a蛋白相对表达量高于对照组(P均<0.05)。实验1、2组PC12细胞PRNP mRNA及p AKT、p Fox O3a蛋白相对表达量低于IGF-1组(P均<0.05),且实验2组低于实验1组(P均<0.05)。结论 IGF-1通过磷酸化PI3K/AKT/Fox O信号通路蛋白AKT、Fox O3a调节PC12细胞PRNP基因表达。

绵羊PRNP等位基因PCR-SSCP分析条件的优化

为进行绵羊PRNP等位基因密码子136、154、171的多态性研究,建立适合于绵羊PRNP等位基因开放阅读框(ORF)内高变区PCR-SSCP分析方法,对凝胶浓度、交联度、甘油浓度、电泳电压、电泳时间、PCR产物与变性缓冲液比例、电泳缓冲液浓度、上样量等影响因素进行了优化试验。在优化中引入了正交试验法,以使优化过程简化,结果可靠。结果表明,交联度49∶1、甘油浓度0%、凝胶浓度12%、电泳电压200 V、PCR产物上样量≥2.0μL且<4.0μL、PCR产物与变性缓冲液比例1∶4、0.5×TBE缓冲液及4℃电泳45 h为最佳试验条件,据此建立了绵羊PRNP等位基因136、154、171密码子的PCR-SSCP分析方法。

不同月龄PRNP基因敲除小鼠的行为学观察

利用Prnp0/0型青年鼠和老年鼠,通过水迷宫试验、跳台试验和自主活动试验,探讨Prnp0/0型小鼠从青年到老年是否遵循学习和记忆能力下降的一般生理规律,从而反映PrPc蛋白是否对神经系统的老化过程有影响。结果表明:在Morris水迷宫定位航行试验中,2组鼠的潜伏期在统计学上差异不显著,但是青年鼠的潜伏期均低于老年鼠;在空间探索试验中,Prnp0/0型青年鼠穿越平台次数比老年鼠多,差异显著(P<0.05),青年鼠第1次穿越平台的时间比老年鼠短。在跳台试验中,Prnp0/0型青年鼠和老年鼠第1天的错误次数差异显著(P<0.05),24 h后错误次数差异极显著(P<0.01),第1次跳下平台的时间即潜伏期差异极显著(P<0.01)。在自主活动试验中,青年鼠较老年鼠活动强,在第4天差异极显著(P<0.01),且随着时间的延长,2组鼠的活动次数都减少。Prnp0/0型青年鼠的学习记忆能力强于老年鼠,反映出PrPc蛋白的缺失并没有显著影响到小鼠神经系统的老化过程。

7例散发性Creutzfeldt-Jakob病患者的PRNP和APOE基因突变/变异检测及其临床意义

目的探讨散发性Creutzfeldt-Jakob病(CJD)与朊蛋白(PRNP)基因、载脂蛋白E(APOE)基因突变/变异的关系。方法对临床很可能的7例CJD患者的PRNP基因的开放阅读框架及APOE基因第四外显子进行PCR扩增,产物直接测序,异常者重复测序。结果发现1例患者存在PRNP基因E200K杂合突变,6例患者为PRNP基因129基因型MM,1例患者存在APOE基因ε4等位基因。结论 PRNP基因E200K突变为CJD致病性突变,129MM基因型与散发性CJD易感性相关,APOE基因ε4等位基因可能与散发性CJD进展有关。

牛源粪肠球菌人工感染BALB/c雌鼠肾脏组织过程中PRNP和PRND的表达变化研究

为了研究牛源粪肠球菌感染对小鼠PRNP和PRND基因表达水平的影响,用牛源粪肠球菌感染小鼠,在1~7 d内解剖小鼠,制作病理组织革兰氏染色及石蜡切片HE染色,最后通过荧光定量PCR检测感染后1~7 d内PRNP和PRND的表达情况。结果表明:牛源粪肠球菌感染BALB/c雌鼠后,肾脏组织病变较明显,实时荧光定量检测确实对PRNP和PRND基因的表达量存在影响;球菌感染PRNP和PRND基因在每个时段的表达量均高于空白对照组。说明小鼠肾脏的PRNP和PRND基因的表达水平随着感染时间的改变而发生变化。

小尾寒羊PRNP等位基因密码子136、154和171的多态性研究

为研究小尾寒羊PRNP等位基因密码子多态性,本研究以绵羊全血基因组DNA为模版,通过PCR,扩增绵羊PRNP等位基因目的片段,并将其克隆于pMD-18T载体。经SSCP法筛选出阳性克隆后测序,确定各绵羊PRNP136位、154位和171位密码子等位基因型及频率分布。在104只绵羊中共检出15个PRNP136位、154位和171位密码子等位基因型,痒病易感基因型占优势(53.85%,56/104)。本研究证明,该绵羊群属于痒病易感/易发群体,一旦痒病传入具有罹患痒病的极大可能性。

马立克氏病鸡组织中PRNP基因表达量分析

【目的】探明PRNP基因表达量与鸡马立克氏病发病之间的关系.【方法】从甘肃省康乐县某养鸡场采集马立克(MD)病鸡组织样品,通过RT-PCR检测MDV致瘤相关基因Meq和pp38以及病理组织学观察将样品分为MD肿瘤病变鸡、MD无病变鸡与健康鸡,最后通过荧光定量PCR方法分析3组中PRNP基因mRNA水平的相对表达量的差异.【结果】MD无病变鸡中PRNP基因的表达规律与健康鸡基本一致,但与MD肿瘤病变鸡完全不同;除脑外,MD病鸡组织PRNP基因的表达量均高于健康鸡,其中肿瘤病变组织PRNP基因的表达量显著高于无病变组织(P<0.05),而且PRNP基因在MD病鸡肿瘤病变组织与健康鸡组织的表达差异与肿瘤病变程度有关.【结论】PRNP基因的表达量与MDV感染存在相关性,PRNP基因在MD肿瘤组织中过表达,且PRNP基因的差异表达与肿瘤病变程度有关.

PRNP基因在3T3-L1脂肪前体细胞分化过程中的表达及肿瘤坏死因子-α对其调节作用

目的探讨3T3-L1脂肪前体细胞诱导分化过程中PRNP基因表达水平的变化及TNF-α对其调节作用。方法体外培养3T3-L1前体脂肪细胞,胰岛素加地塞米松加1-甲基-3-异丁基黄嘌呤（MDI）方案诱导3T3-L1细胞分化成熟,并收集分化前、分化0～10 d各时段细胞,采用RT-PCR技术检测诱导分化不同时段3T3-L1细胞PRNP基因表达水平;同时在成功诱导3T3-L1细胞分化成熟的基础上,应用不同水平TNF-α（0.1、1.0、10.0μg/L）干预分化后的成熟脂肪细胞（第10天）,收集TNF-α刺激前（0 h）及刺激后0.5、2.0、6.0、12.0、24.0 h的脂肪细胞,通过RT-PCR测定TNF-α干预前后不同时间点脂肪细胞中PRNP基因表达水平。采用Excel软件进行统计学分析。结果1.PRNP基因低表达于3T3-L1脂肪前体细胞中,随细胞分化成熟该基因表达水平逐渐上调,至分化第10天其表达水平最高。PRNP基因表达水平除在诱导分化前（第-1天）至第4天、第2～5天、第6～10天时段内无显著性差异外（Pa〉0.05）,其余各时段间表达水平均有显著性差异（Pa〈0.05）;2.在分化前的3T3-L1脂肪细胞和成熟脂肪细胞中,不同水平TNF-α（0.1、1.0、10.0μg/L）均能在短时间内明显抑制PRNP基因mRNA的表达,且呈时间依赖性。结论PRNP基因可能参与3T3-L1脂肪细胞分化及脂质积聚过程;不同水平重组TNF-α对成熟脂肪细胞的PRNP基因表达具有抑制作用,其抑制效应总体趋势上呈时间依赖性。

山羊PRNP基因启动子转录活性研究

【目的】分析山羊PRNP基因启动子活性区域,旨在筛选调节朊蛋白表达水平的关键区域或转录因子,为阐明山羊PRNP基因的表达调控提供理论依据,并为从遗传学角度降低朊蛋白病的发生提供思路;【方法】以山羊PRNP基因序列(Gen Bank登录号:EU870890)为模板,设计特异性引物,扩增山羊PRNP基因5′侧翼区片段,并将扩增片段克隆至p EASY-T3载体,鉴定为阳性的克隆进行测序;利用生物信息学方法和在线工具进行启动子区域和转录因子结合位点的预测;利用缺失突变技术扩增启动子区不同长度的片段11个,并克隆至p EASY-T3载体后,鉴定为阳性的质粒和pGL3-Basic载体分别用限制性内切酶Mlu I和Bgl II进行酶切,并回收酶切产物;利用T4连接酶进行目的片段与pGL3-Basic连接,鉴定为阳性的荧光素酶报告基因重组质粒进行测序,并提取无内毒素质粒,用脂质体转染法瞬时转染至SH-SY5Y细胞,转染48h后,利用双荧光素酶检测试剂盒进行各缺失突变重组质粒在细胞内的启动活性检测;【结果】成功克隆了山羊PRNP基因5′侧翼区片段,长度为2 332 bp,且该片段含有预测的启动子活性区域、保守的motifs和多个转录因子的结合位点;成功克隆了11个含有不同长度启动子的片段,并与荧光素酶报告基因连接,并构建了目的片段与荧光素酶报告基因的重组质粒;转染时脂质体与DNA的比例为1﹕0.5,萤火虫荧光素酶载体与海肾荧光素酶比例为50﹕1;山羊PRNP基因5′侧翼区存在着核心启动子,启动子活性最强的区域为-519—+82 bp,且在-220—+59 bp这一区域存在着正调控元件,外显子1对启动子活性中起重要的调控作用;4个motifs可能为正调控元件结合位点;在强启动子活性区存在10个Sp1结合位点,2个AP-2 alpha结合位点和1个AP-1结合位点;山羊PRNP基因motif 3和motif 4分别预测为转录因子Foxp3和COE1的结合位点。【结论】确定了山羊PRNP基因启动子的核心区域(-519—+82bp),外显子1对启动子活性起重要的调控作用。

新疆地方绵羊品种PRNP基因多态性研究

从新疆采取了8个地方绵羊品种的血液样品171份,提取绵羊基因组DNA,用PCR方法扩增绵羊PRNP基因,通过序列测定,对它们的PRNP基因型进行研究,确定了PRNP基因136、154、171位密码子的多态性为136(A/A),154(H/R)和171(Q/R/H/K),结果发现所检测的新疆地方绵羊品种PRNP基因136位密码子均为A,其基因型均为A型痒病抵抗性基因型。

PRNP基因八肽重复突变研究进展

某些遗传性朊病毒病,例如,家族性Creutzfeldt-Jakob病(fCJD)、GSS综合征均与PRNP基因八肽重复区插入突变相关。关于插入突变Prp分子的研究对于揭示遗传性朊病毒病发病机制具有重要意义。

利用启动子缺陷型打靶载体敲除牛胎儿成纤维细胞中的Prnp

利用启动子捕获对中靶细胞进行富集是提高体细胞基因打靶效率常用的策略之一。敲除动物的Prnp可使其具有抵抗Prion病感染的能力。采用启动子捕获策略,构建了牛Prnp启动子缺陷型打靶载体BoPrneo,线性化后,再通过电穿孔转染牛胎儿成纤维细胞BFF,用250μg/mL G418进行药物筛选,共得到99个药物抗性细胞克隆。对细胞克隆进行PCR、测序及Southern blotting鉴定,结果表明,其中的4个细胞克隆为中靶细胞,说明牛胎儿成纤维细胞中的Prnp一条等位基因被成功敲除。本研究为牛Prnp的敲除提供了一种简单、安全、有效的方法。

金黄色葡萄球菌ATCC25923人工感染BALB/c雌鼠肾脏组织PRNP和PRND的表达变化研究

目的为了研究细胞型朊蛋白和Doppel蛋白在金黄色葡萄球菌感染中的作用。方法本实验用金黄色葡萄球菌ATCC25923感染BALB/c雌鼠后,分别在1~7 d内解剖小鼠,进行组织抹片革兰氏染色和石蜡切片制作,最后采用荧光定量PCR检测PRNP和PRND在1~7 d中的相对表达量。结果金黄色葡萄球菌最先出现在肾脏,且对肾脏组织有损伤作用;PRNP和PRND基因在每个时段的表达量都高于空白对照组,其中PRNP在第1 d的表达量最高,为空白对照组的6.1倍,PRND在第2 d的表达量最高,为空白对照组的13.1倍。结论小鼠肾脏的PRNP和PRND的mRNA表达水平随着金黄色葡萄球菌感染的时间发生变化。

荷斯坦公牛PRNP多态性与精子活力相关性及抗病性评估

为分析荷斯坦公牛朊蛋白基因(PRNP)多态性与精子活力的关系,并对其抗病性进行评估,选育抗病公牛,本实验以公牛精液为样品,研究PRNP基因中12 bp、23 bp和24 bp 3个片段的插入/缺失多样性、基因mRNA转录水平及其与精子活力等指标的关系。结果表明,12 bp和23 bp在群体中均得到3种基因型,24 bp只有2种基因型。不同基因型群体的mRNA转录水平存在显著差异,而基因型与精液产量和活力等指标存在相关性,抗病力和精子活力指标存在负相关。本研究中3个片段的插入-缺失多样性可以作为公牛选育的辅助标记。

鸡Prnp基因原核表达载体的构建及其在大肠埃希菌中的表达

试验旨在构建鸡Prnp基因原核表达载体,并在大肠埃希菌中进行表达,为制备鸡朊蛋白单克隆抗体提供材料。根据GenBank已报道的鸡Prnp基因组序列和pET-28a质粒多克隆位点设计引物,以健康的鸡全血基因组DNA为材料,采用PCR的方法扩增鸡的Prnp基因,将目的基因片段与pET-28a载体连接,构建重组原核表达载体。重组菌转化到E.coli BL21(DE3)感受态细胞中,并用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG)进行诱导表达,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定表达的重组蛋白。结果表明,重组蛋白在诱导剂的终浓度为0.08 mmol·L^-1,16℃,220 r·min^-1诱导7 h,蛋白表达量最高。综上所述,本研究成功构建了pET-28a-Ch Prnp重组表达菌株,为Prnp朊蛋白的结构、生理功能和致病机制研究提供方法。

反刍家畜朊蛋白基因(PRNP)多态性及其遗传效应研究进展

朊蛋白基因(PRNP)不仅与动物传染性海绵样脑病(TSEs)密切相关,还与反刍家畜的表型性状密切相关。已有研究表明:牛、水牛、牦牛、绵羊、山羊等反刍家畜PRNP基因具有丰富的多态性,同时,这些遗传变异位点在这些物种中又具有显著差异性;其中,牛、绵羊和山羊PRNP基因多态性与BSE、瘙痒病显著相关;牛、绵羊和山羊PRNP基因多态性与生产性能有密切相关性。为此,本文从反刍家畜PRNP基因结构比较、反刍家畜PRNP基因多态性研究、反刍家畜PRNP多态性与疾病的关系、反刍家畜PRNP多态性与生产性能的关系等四方面进行综述,以期为反刍家畜优良个体及品种的高效选育提供理论参考。

阿尔茨海默病与PRNP突变体小鼠动物模型

阿尔茨海默病是由β淀粉样蛋白造成的人类神经损伤性痴呆病之一,目前尚无治疗办法。朊蛋白是β淀粉样蛋白的受体,是阿尔茨海默病发病过程的关键蛋白之一,具有传递神经毒性和保护神经细胞的双重作用。人朊蛋白编码基因(PNRP)多态性影响阿尔茨海默病的潜伏期和临床症状,而PRNP突变体小鼠的发现提升了动物模型在朊蛋白疾病研究中的应用价值,在一定程度上弥补了现有阿尔茨海默病动物模型的不足。本文总结了朊蛋白在阿尔茨海默病病理中的作用及PRNP突变对阿尔茨海默病的影响,并详细总结了PRNP突变体小鼠的发现及在蛋白沉淀样病变研究中的应用和价值,旨在为阿尔茨海默病动物模型研究提供理论参考。